GADD45B agravează leziunile intestinale de ischemie-reperfuzie prin activarea axei epigenetice TET1/MST1 și a căii Hippo

Un studiu realizat la Dalian Medical University a investigat mecanismele moleculare implicate în leziunile intestinale produse de ischemie-reperfuzie (I/R) și a identificat un rol central pentru proteina GADD45B în amplificarea apoptozei și a afectării tisulare. Cercetarea arată că GADD45B interacționează cu TET1 pentru a induce demetilarea ADN a genei MST1, activând astfel calea Hippo și agravând distrucția intestinală.

Context

Leziunile intestinale de ischemie-reperfuzie reprezintă o complicație severă întâlnită în numeroase situații clinice, inclusiv obstrucția intestinală acută sau cronică, transplantul de intestin subțire, disfuncțiile mezenterice și sepsisul.

În timpul ischemiei apare reducerea fluxului sangvin și a aportului de oxigen către intestin, urmată ulterior de reperfuzie. Deși reperfuzia este necesară pentru supraviețuirea țesutului, aceasta poate declanșa un răspuns inflamator și oxidativ sever, caracterizat prin:

• producție excesivă de radicali liberi;
• distrugerea barierei intestinale;
• translocația bacteriană;
• eliberarea endotoxinelor în circulație;
• disfuncție multiorganică.

În prezent, tratamentele pentru leziunile intestinale de ischemie-reperfuzie sunt limitate. Strategiile farmacologice nu au demonstrat beneficii clinice majore, iar metodele mecanice precum precondiționarea ischemică sunt invazive și dificil de aplicat universal.

Proteina GADD45B face parte din familia genelor GADD45, implicată în răspunsul celular la stres și leziuni ADN. Aceasta participă la procese precum:

• repararea ADN;
• demetilarea ADN;
• stabilitatea genomică;
• reglarea ciclului celular;
• apoptoza;
• răspunsurile inflamatorii.

Studii anterioare au arătat că GADD45B este intens exprimată în ischemia-reperfuzie cerebrală, cardiacă și renală, însă rolul său în ischemia intestinală nu fusese elucidat până acum.

Cercetătorii au suspectat că GADD45B ar putea favoriza moartea celulară prin modificări epigenetice, în special prin demetilarea promotorului genei MST1, o kinază proapoptotică esențială pentru activarea căii Hippo.

 

Despre studiu

Studiul a utilizat atât modele animale, cât și modele celulare de ischemie-reperfuzie intestinală.

Modelul animal

Cercetătorii au folosit șoareci masculi C57BL/6J cu vârste între 8 și 10 săptămâni. Ischemia intestinală a fost indusă prin ocluzia arterei mezenterice timp de 45 de minute, urmată de reperfuzie pentru:

• 1 oră;
• 2 ore;
• 4 ore;
• 8 ore.

Pentru a evalua rolul GADD45B, un grup de șoareci a primit vectori virali AAV conținând „short hairpin RNA” (shRNA) împotriva GADD45B, pentru inhibarea expresiei acestei proteine.

 

Modelul celular

Au fost utilizate celule epiteliale intestinale umane Caco-2. Pentru simularea ischemiei-reperfuzie, celulele au fost expuse:

• 12 ore la hipoxie severă (1% oxigen);
• urmate de reoxigenare pentru 1–8 ore.

Cercetătorii au utilizat:

 

• siRNA pentru inhibarea GADD45B, TET1 și MST1;
• plasmide pentru supraexprimarea GADD45B și TET1;
• RNA-seq;
• Western blot;
• imunofluorescență;
• TUNEL pentru detectarea apoptozei;
• analize de metilare ADN;
• Chromatin Immunoprecipitation (ChIP);
• coimunoprecipitare (Co-IP).

GADD45B crește semnificativ după ischemie-reperfuzie intestinală

Analizele RNA-seq anterioare identificaseră deja GADD45B printre cele mai puternic supraexprimate gene după ischemie-reperfuzie intestinală umană.

În acest studiu, expresia GADD45B a crescut marcat atât în intestinul șoarecilor, cât și în celulele Caco-2 după ischemie-reperfuzie sau hipoxie/reoxigenare.

Expresia maximă a fost observată la aproximativ 4 ore după reperfuzie.

Cercetătorii au observat că această creștere era asociată cu:

• activarea căii p38 MAPK;
• activarea JNK;
• stres oxidativ;
• leziuni ADN.

Inhibarea GADD45B reduce leziunile intestinale și apoptoza

Șoarecii la care GADD45B a fost inhibată au prezentat o ameliorare semnificativă a leziunilor intestinale după ischemie-reperfuzie.

Principalele efecte observate au inclus:

• reducerea apoptozei;
• ameliorarea integrității barierei intestinale;
• scăderea activării NF-κB;
• diminuarea inflamației;
• reducerea leziunilor histologice intestinale.

Testele TUNEL au arătat un număr mult mai redus de celule apoptotice în intestinul șoarecilor cu knockdown GADD45B.

În plus, markerii moleculari ai apoptozei au fost modificați favorabil:

• scăderea Bax;
• scăderea caspazei-3 activate;
• creșterea Bcl-2.

Rezultate similare au fost observate și în modelul celular Caco-2.

 

Supraexprimarea GADD45B agravează afectarea intestinală

Atunci când GADD45B a fost supraexprimată în celulele Caco-2, efectele ischemiei-reperfuzie au devenit mult mai severe.

Au fost observate:

• distrugerea accentuată a barierei intestinale;
• creșterea apoptozei;
• majorarea numărului de celule TUNEL pozitive;
• activare inflamatorie intensificată.

Aceste rezultate confirmă rolul proapoptotic și dăunător al GADD45B în ischemia intestinală.

 

GADD45B activează calea Hippo

Analizele transcriptomice RNA-seq au arătat că una dintre cele mai afectate căi moleculare după modificarea expresiei GADD45B a fost calea Hippo, un sistem de semnalizare esențial pentru reglarea:

• proliferării celulare;
• apoptozei;
• homeostaziei tisulare.

Calea Hippo este activată prin MST1 și LATS1, care ulterior inhibă proteinele YAP și TAZ.

Rezultatele au arătat că inhibarea GADD45B a redus:

• MST1;
• fosforilarea MST1;
• LATS1;
• raportul p-YAP/YAP;
• fosforilarea TAZ.

În schimb, supraexprimarea GADD45B a produs efecte opuse, activând puternic calea Hippo.

 

GADD45B induce demetilarea ADN a promotorului MST1

Cercetătorii au observat că promotorul genei MST1 conține insule CpG susceptibile la reglare epigenetică prin metilare ADN.

În mod normal, metilarea ADN inhibă expresia genelor, iar demetilarea favorizează activarea acestora.

Analizele MSP (PCR specific metilației) au demonstrat că:

• ischemiareperfuzia reduce metilarea promotorului MST1;
• inhibarea GADD45B crește metilarea MST1;
• supraexprimarea GADD45B reduce și mai mult metilarea MST1.

Aceste rezultate sugerează că GADD45B stimulează expresia MST1 prin demetilarea ADN.

Experimentele ChIP au confirmat că GADD45B se leagă direct de regiunea promotorului MST1.

 

GADD45B cooperează cu TET1

Proteinele TET sunt enzime implicate în demetilarea ADN prin conversia 5-metilcitozinei în 5-hidroximetilcitozină.

Studiul a demonstrat că:

• TET1 este supraexprimată după ischemie-reperfuzie;
• GADD45B interacționează fizic cu TET1;
• TET1 este recrutată la promotorul MST1 în prezența GADD45B.

Experimentele Co-IP au confirmat interacțiunea directă dintre cele două proteine.

În plus, inhibarea TET1 a blocat demetilarea MST1 indusă de GADD45B.

Autorii concluzionează că GADD45B funcționează ca o proteină „punte”, facilitând recrutarea TET1 către promotorul MST1 și activarea epigenetică a acestei gene.

 

MST1 este esențială pentru efectele proapoptotice ale GADD45B

Pentru a confirma rolul MST1, cercetătorii au inhibat MST1 în celulele cu supraexprimare GADD45B.

Knockdown-ul MST1 a redus semnificativ:

• activarea căii Hippo;
• apoptoza;
• distrugerea barierei intestinale;
• numărul de celule apoptotice.

Aceste date demonstrează că efectele proapoptotice ale GADD45B depind, cel puțin parțial, de axa MST1/Hippo.

 

Inhibarea GADD45B reduce afectarea organelor la distanță

Leziunile intestinale severe pot induce afectare hepatică și pulmonară secundară prin translocație bacteriană și inflamație sistemică.

În studiul actual, inhibarea GADD45B a redus:

• leziunile histologice hepatice;
• leziunile pulmonare;
• nivelurile ALT și AST;
• activitatea MPO pulmonară;
• citokinele inflamatorii TNF-α și IL-6.

Aceste rezultate sugerează că GADD45B contribuie nu doar la afectarea intestinală locală, ci și la dezvoltarea sindromului de disfuncție multiorganică.

 

Concluzii

Acest studiu demonstrează că GADD45B joacă un rol central în agravarea leziunilor intestinale de ischemie-reperfuzie prin stimularea apoptozei și activarea căii Hippo.

Mecanismul identificat implică:

• interacțiunea dintre GADD45B și TET1;
• demetilarea promotorului MST1;
• activarea MST1;
• stimularea căii Hippo;
• intensificarea morții celulare și a inflamației.

Autorii consideră că axa GADD45B/TET1/MST1 reprezintă o posibilă țintă terapeutică pentru prevenirea și tratamentul leziunilor intestinale de ischemie-reperfuzie și al complicațiilor sistemice asociate.