Microelectrozi tridimensionali imprimați inkjet permit înregistrări neuronale de mare precizie în organoide cerebrale umane

În ianuarie 2025, o echipă de cercetători de la Technical University of Munich și Helmholtz Center Munich, a publicat în ACS Nano un studiu ce descrie o metodă revoluționară de fabricare a microelectrozilor tridimensionali (3D MEA) prin combinarea imprimării inkjet, a fasciculului de ioni focalizat (FIB) și a electrodepunerii, cu aplicații directe în înregistrarea activității neuronale din organoide cerebrale derivate din celule stem pluripotente induse (hiPSC).

Context

Progresele recente în neuroștiințele celulare au condus la dezvoltarea organoidelor cerebrale – structuri tridimensionale auto-organizate, compuse din diferite tipuri de celule neuronale și gliale, care reproduc arhitectura și conectivitatea creierului uman în miniatură. Aceste modele permit studierea rețelelor neuronale umane fără a fi nevoie de modele animale, oferind un cadru valoros pentru înțelegerea dezvoltării cerebrale și a bolilor neurodegenerative.

Totuși, monitorizarea activității electrice în aceste structuri 3D este dificilă. Microelectrozii tradiționali bidimensionali (planari) pot capta semnale doar de la suprafață, neputând accesa straturile interne ale organoidului. De aceea, în ultimii ani, s-au dezvoltat MEA-uri flexibile, extensibile sau tip plasă, capabile să se integreze parțial în volum. Cu toate acestea, aceste tehnologii rămân limitate în ceea ce privește rezoluția spațială multiplanară, timpul de fabricație și precizia geometrică a microelectrozilor.

Despre studiul actual

Pentru a depăși aceste limitări, echipa lui Wolfrum a propus o metodă integrată care combină:

• litografie fără mască (maskless lithography) – pentru definirea liniilor de alimentare și a padurilor de contact;

• imprimare inkjet de precizie – pentru formarea pilonilor conductivi din nanoparticule de argint;

• măcinare cu fascicul de ioni focalizat (FIB) – pentru deschiderea controlată, la nivel micron, a vârfului electrozilor;

• electrodepunere pulsatilă de aur (pulsed electrodeposition) – pentru biocompatibilizare și reducerea impedanței.

Această combinație a permis realizarea unor microstructuri 3D cu un raport înălțime–diametru de 44:1, cu înălțimi de până la 1 mm și deschideri precise de 3 sau 6 μm.

Electrozii au fost fabricați pe substraturi rigide de sticlă, acoperite ulterior cu parylenă C pentru izolare electrică și protecție mecanică, lăsând descoperit doar vârful activ prin procesul de FIB.

Procesul complet asigură o densitate mare de electrozi fără compromiterea aspectului tridimensional, un avantaj major față de tehnicile clasice de microfabricare în cameră curată.

Caracterizarea electrozilor

Calitatea electrozilor a fost evaluată prin:

• microscopie electronică de baleiaj (SEM) – pentru confirmarea dimensiunilor (3,1 ± 0,1 μm și 6,0 ± 0,1 μm);

• voltametrie ciclică (CV) – care a demonstrat acoperirea completă cu aur prin dispariția vârfurilor de oxidare/reducere ale argintului;

• spectroscopie de impedanță electrochimică (EIS) – la 1 kHz, impedanța a scăzut de la 8,3 ± 2,1 MΩ (3 μm) și 4,5 ± 2,4 MΩ (6 μm) înainte de placare, la 1,7 ± 0,5 MΩ și respectiv 0,85 ± 0,42 MΩ după placarea cu aur.

Testele de stabilitate electrochimică au confirmat absența oricăror defecte de izolație în stratul de parylenă C.

Această arhitectură asigură zgomot electric extrem de scăzut, cu o valoare RMS minimă de 0,2 pA, adecvată pentru măsurători amperometrice sensibile.

Rezultate – Înregistrări în organoide corticale umane

Organoidele corticale derivate din hiPSC au fost cultivate până la 24 de luni, perioadă în care au dezvoltat straturi neuronale similare cu cortexul uman, exprimate prin markeri precum NeuN, TBR1, CUX1 și BCL11B.

Cercetătorii au realizat două tipuri de experimente:

• Înregistrări in situ – organoidele au fost plasate direct pe rețelele 3D MEA.

• Înregistrări după 10 zile de cultură pe electrozi – pentru a permite o mai bună integrare celulă–electrod.

Fiecare rețea a conținut 16 electrozi activi (8 de 3 μm și 8 de 6 μm), cu înălțimi medii de 400–500 μm.

Activitate neuronală observată

• În ambele tipuri de experimente s-au detectat descărcări spontane și grupate (bursting), indicând rețele neuronale funcționale.

• Electrozii de 6 μm au înregistrat amplitudini medii ale vârfurilor de 626 ± 62 pA, în timp ce cei de 3 μm au prezentat 350 ± 56 pA.

• Zgomotul RMS a fost mai redus la electrozii mai mici (0,3 ± 0,1 pA față de 0,7 ± 0,3 pA).

După 10 zile de co-cultură, semnalele au devenit mai sincronizate și coordonate, cu 38% dintre canale afișând descărcări sincrone.

Timpul de întârziere între electrozi a permis estimarea unei viteze de propagare a semnalului de 1,2 m/s, valoare comparabilă cu conducerea axonală fiziologică umană (0,5–2 m/s).

Sincronizarea crescută a activității neuronale a fost corelată cu maturizarea progresivă a rețelei, reflectând formarea conexiunilor sinaptice funcționale în interiorul organoidului.

Discuție

Rezultatele demonstrează că electrozii 3D fabricați prin imprimare inkjet și rafinați prin FIB permit înregistrări selective din straturi adânci ale organoidelor fără a le deteriora.

Spre deosebire de tehnologiile laser, metoda FIB oferă control submicronic al deschiderii electrozilor, permițând ajustarea fină a rezoluției spațiale și a raportului semnal-zgomot.

Un aspect notabil al studiului este demonstrarea că electrozii mai mici generează zgomot redus în măsurători amperometrice, chiar dacă amplitudinile semnalului scad ușor – o proprietate utilă pentru aplicații de înregistrare a evenimentelor de eliberare de neurotransmițători la nivel unicelular.

Autorii propun ca următoarele direcții de cercetare să includă:

• utilizarea materialelor alternative la argint pentru eliminarea completă a riscului citotoxic;

• optimizarea distanței dintre electrozi (pitch) și a materialelor conductoare;

• dezvoltarea de platforme multifuncționale, capabile să realizeze simultan înregistrări electrice și chimice (de exemplu, ale neurotransmițătorilor redox-activi).

Concluzii

Studiul realizat de echipa de la Technical University of Munich reprezintă un salt tehnologic major în neuroelectronică.

Prin combinarea imprimării inkjet, a microfrezării cu ioni și a electrodepunerii controlate, cercetătorii au creat o metodă rapidă, scalabilă și personalizabilă de fabricare a microelectrozilor 3D de înaltă precizie.

Acești senzori permit:

• măsurători amperometrice cu zgomot extrem de redus (până la 0,2 pA RMS);

• înregistrarea multiplanară a activității neuronale în organoide umane mature;

• observarea sincronizării spontane a rețelelor neuronale în dezvoltare.

Această tehnologie deschide perspective noi pentru analiza electrochimică și funcțională a organoidelor cerebrale, oferind o platformă de înaltă rezoluție pentru studiul dezvoltării, conectivității și disfuncțiilor neuronale în condiții fiziologice și patologice.