O nouă abordare terapeutică vizează proteina PCSK9 pentru reglarea nivelului de colesterol din sânge

Într-un studiu publicat în Biochemical Pharmacology, cercetători de la Universitatea de Sănătate și Știință din Oregon și Universitatea din Barcelona au testat pentru prima dată o nouă strategie de terapie genică pentru scăderea colesterolului, bazată pe oligonucleotide agrafe polipurinice Reverse Hoogsteen (PPRH), îndreptate împotriva genei PCSK9. Aceste molecule experimentale, administrate la șoareci transgenici ce exprimă proteina umană PCSK9, au redus semnificativ nivelurile de PCSK9 și colesterol plasmatic, fără a produce toxicitate.
Proteina PCSK9 este un regulator cheie al metabolismului colesterolului. Prin interacțiunea cu receptorul pentru lipoproteine cu densitate mică (LDLR), PCSK9 promovează degradarea acestuia, ceea ce duce la creșterea nivelului de colesterol LDL plasmatic. Inhibitorii actuali ai PCSK9 – anticorpi monoclonali (e.g. evolocumab, alirocumab) și siRNA (inclisiran) – sunt eficienți în scăderea colesterolului LDL, dar sunt costisitori și necesită administrare repetată.

Terapia genică bazată pe oligonucleotide PPRH oferă o alternativă inovatoare și mai accesibilă, având deja aplicații promițătoare în oncologie. Acest studiu aduce prima dovadă a eficienței acestor molecule în tratamentul bolilor metabolice.

Despre studiu

Cercetătorii au proiectat două oligonucleotide PPRH, denumite HpE9 și HpE12, care vizează regiunile exonice 9 și 12 ale genei umane PCSK9. Aceste oligonucleotide formează structuri de triplex ADN cu regiunile complementare bogate în pirimidine, inhibând astfel transcripția genei țintă.

Pentru livrarea intracelulară, PPRH-urile au fost complexate cu polimerul cationic jetPEI, optimizat la un raport molar azot/fosfat (N/P) de 7–8, asigurând formarea de nanoparticule stabile, cu diametru de aproximativ 170–200 nm.

Etape experimentale

• In vitro: Celule HepG2 umane au fost transfectate cu 250 nM de HpE9 sau HpE12. Expresia PCSK9 a fost evaluată prin RT-qPCR și Western blot.
• In vivo: Șoareci transgenici exprimând PCSK9 uman au primit injecții intraperitoneale cu HpE12 (100 µg). Nivelurile de PCSK9 și colesterol au fost monitorizate pe parcursul a 15 zile.
• Toxicitate: Șoareci C57BL/6 au fost tratați cu HpE9, iar parametrii biochimici și comportamentali au fost evaluați timp de 10 zile.

Rezultate

1. Eficiența de legare și internalizare celulară

PPRH-urile s-au legat specific la secvențele țintă, formând complexe stabile de triplex. Valorile de afinitate (Kd) au fost de ordinul 10⁻⁷–10⁻⁸ M. Internalizarea eficientă a fost demonstrată în celulele HepG2, cu peste 90 % celule fluorescente după transfectarea cu PPRH marcat fluorescent (HpSc-FAM).

2. Inhibarea expresiei PCSK9 în celule HepG2

Transfectarea cu HpE9 și HpE12 a redus:

• Expresia ARNm PCSK9 cu 63–74 % la 24 h, menținându-se la 54–82 % la 48 h.
• Proteina intracelulară PCSK9 (62 kDa) a fost redusă cu 89–96 %.
• PCSK9 secretată în mediul extracelular a scăzut în mod semnificativ.

În paralel, expresia proteinei LDLR a crescut cu 218–253 % după transfectare cu HpE12, confirmând eficiența terapeutică.

3. Scăderea PCSK9 și colesterolului la șoareci transgenici

Într-un pre-test cu două injecții repetate:

• HpE12 a redus nivelul plasmatic de PCSK9 cu 58–69 % în 5 zile.
• HpE9 a avut un efect mai variabil (25–46 %), fiind ales pentru testarea toxicității.

Într-un experiment cu o singură injecție de HpE12 (100 µg):

• PCSK9 a scăzut de la 900 ng/mL la 472 ng/mL la ziua 2 (−48 %, p = 0.002).
• Colesterolul seric a scăzut de la 289 mg/dL la 151 mg/dL la ziua 3 (−48 %, p = 0.002).
• Valorile au revenit la aproape normal în 15 zile, sugerând un efect tranzitor.

4. Siguranța administrării în vivo

Evaluările de toxicitate la șoareci C57BL/6 nu au arătat:

• Modificări semnificative ale greutății corporale sau consumului alimentar.
• Creșteri ale enzimelor hepatice (ALT, AST) sau ale markerilor inflamatori (CRP, TNF-α).

Nu s-au observat diferențe între sexe.

Concluzii

Această lucrare oferă prima demonstrație experimentală a utilizării oligonucleotidelor PPRH pentru inhibarea expresiei PCSK9, atât in vitro, cât și in vivo. Molecula HpE12 a fost eficientă în reducerea nivelurilor de PCSK9 și colesterol, cu un profil de siguranță favorabil.

Această abordare prezintă mai multe avantaje:

• Costuri mai reduse comparativ cu anticorpii monoclonali sau siRNA.
• Stabilitate crescută în ser și celule.
• Efect tranzitoriu fără tăiere ADN (comparativ cu CRISPR).
• Lipsa reacțiilor imune și a efectelor adverse majore.

PPRH reprezintă o platformă promițătoare pentru tratamente genice în boli metabolice și cardiovasculare. Următorii pași includ:

• Compararea cu terapiile actuale (statine, iPCSK9).
• Testarea în combinație cu alte medicamente hipolipemiante.
• Optimizarea livrării, de exemplu prin GalNac (folosit și în Inclisiran), pentru a crește specificitatea hepatică și durata efectului.

PPRH împotriva PCSK9 poate deveni o strategie de viitor în tratamentul hipercolesterolemiei și prevenția bolilor cardiovasculare.