Pentru prima dată, ADN-ul conceput de IA controlează genele din celulele sănătoase de mamifere

Un studiu publicat în revista Cell, realizat de Velten și colaboratorii săi de la Centre for Genomic Regulation (CRG) din Barcelona, abordează un paradox fundamental în biologia celulelor stem hematopoietice: cum reușesc aceste celule să transforme expresia gradientă a factorilor de transcripție în modele precise, binare de exprimare genică specifice fiecărei stări celulare. Autorii propun o abordare sintetică și sistematică a acestei probleme, folosind enhanceri artificiali pentru a descifra regulile de funcționare ale codului cis-regulator.
În procesul de diferențiere hematopoietică, factori de transcripție esențiali (precum Spi1, Cebpa, Gata1) sunt exprimați în gradienți suprapuși în celulele stem și progenitoare. Cu toate acestea, genele țintă ale acestor factori prezintă o exprimare restrictivă, specifică fiecărui tip celular. Studiile genomice anterioare, bazate pe mutageneză sau modificări ale nivelului factorilor de transcripție, au fost limitate în capacitatea de a formula reguli predictive privind funcționarea enhancerilor. De aceea, autorii au recurs la o abordare „bottom-up”, folosind secvențe ADN sintetice pentru a cartografia în detaliu interacțiunile factorilor de transcripție în contextul diferențierii celulelor stem hematopoietice.

Despre studiu

Autorii au construit o serie de biblioteci de enhanceri sintetici conținând site-uri de legare pentru 38 de factori de transcripție hematopoietici importanți. Aceste secvențe au fost testate folosind o tehnologie de tip massively parallel reporter assay (MPRA), aplicată în șapte stări celulare distincte ale diferențierii hematopoietice (inclusiv eritroizi și mieloizi) derivate din celule stem murine in vitro.

Studiul a inclus:

• Biblioteci cu site-uri de legare individuale pentru factori de transcripție (Library A).
• Biblioteci cu combinații de două site-uri de legare (Library B și C), pentru a explora interacțiunile dintre factori.
• Biblioteci suplimentare (D–H) pentru testarea ipotezelor emergente, inclusiv combinații complexe sau secvențe naturale.

Au fost analizate peste 64.000 de constructe sintetice, însumând peste 445.000 de măsurători de activitate în celule primare și 100.000 în celulele K562 (linie leucemică umană). Activitatea enhancerilor a fost măsurată prin exprimarea unui reporter viral lentiviral, cu ajustare pentru variațiile introducerii în genom.

Rezultate

1. Dualitatea dependentă de ocuparea site-ului

Anumiți factori (de exemplu Creb1, Sp1, Elk1) s-au comportat ca activatori la niveluri scăzute de ocupare și ca represori la niveluri ridicate de legare. Această dualitate dependentă de ocupare permite ca un enhancer să fie activ doar la concentrații optime ale factorului de transcripție, oferind un mecanism de „filtrare” fină a activității TF.

2. Dualitate dependentă de starea celulară

Unele motive de legare au acționat ca activatori într-un tip celular și ca represori în altul. Această dualitate dependentă de stare celulară poate fi explicată prin variații în nivelurile factorilor, prezența co-factori diferiți, modificări post-translaționale sau alte trăsături de trans-reglare.

3. Dualitate combinatorială

Cea mai notabilă descoperire este că unele combinații de factori activatori pot duce la reprimare în anumite contexte celulare. De exemplu:

• Combinația Fli1-Spi1 sau Cebpa-Gata2 a avut un efect reactiv în unele celule și reactiv în altele.
• Reprimarea a apărut doar la raporturi specifice între site-urile de legare, ilustrând capacitatea enhancerilor de a detecta raporturi între factori de transcripție.

4. Importanța contextului ADN și a distanței între site-uri

Aproximativ 42–56% din variația activității a fost atribuită secvenței ADN de fundal, indicând că site-urile aparent „inerte” influențează semnificativ rezultatul funcțional. De asemenea, distanța și orientarea dintre site-uri au influențat activitatea enhancerilor duali, subliniind rolul „gramaticii” motivelor în reglare.

5. Relevanța în genomul natural

Regulile deduse din enhancerii sintetici s-au aplicat și enhancerilor naturali: combinațiile predictibile de motive din genomul murin au reprodus comportamentele de activare și reprimare observate în bibliotecile sintetice, cu un coeficient de corelație de până la R = 0,79.

6. Proiectare automată de enhanceri specifici stărilor celulare

Folosind modelele antrenate, autorii au generat de novo enhanceri cu modele de activitate predefinite (64 combinații de activare/inactivare între stări celulare). În 75% dintre cazuri, aceste secvențe s-au activat conform planului, iar în 64% au rămas inactive unde era de așteptat. Performanța optimă a fost obținută prin combinarea designului ghidat de reguli cu optimizarea locală bazată pe învățare automată.

7. Comparativ cu celulele canceroase K562

În celulele K562, majoritatea factorilor activatori și-au păstrat funcția, însă numeroși factori repressivi și-au pierdut capacitatea de a inhiba. Interacțiunile neutre și sinergice observate în celulele primare au fost adesea absente, sugerând un peisaj epigenetic dereglat, tipic celulelor canceroase.

Concluzii

Acest studiu conturează trei principii de bază ale funcționării enhancerilor specifici stării celulare în hematopoieză:

• Dualitatea dependentă de ocupare – același TF poate activa sau reprima în funcție de numărul și afinitatea site-urilor.
• Dualitatea dependentă de context celular – activitatea unui site depinde de starea celulară și de co-factori.
• Dualitatea combinatorie – combinații de factori pot genera un răspuns diferit față de factorii individuali.

Aceste descoperiri oferă o explicație mecanistică pentru specificitatea genică în ciuda expresiei suprapuse a TF-urilor și deschid noi posibilități pentru proiectarea rațională de elemente reglatoare sintetice cu specificitate de stare celulară, cu aplicații în ingineria genică și terapiile celulare.