Mini-ficat uman creat în laborator prezice reacțiile adverse individuale la medicamente

Într-un studiu publicat în jurnalul Advanced Science cercetătorii de la Centrul Medical al Spitalului de Copii din Cincinnati au dezvoltat o platformă experimentală scalabilă, complet umană și fără matrice extracelulară pentru a modela răspunsurile imune adaptive în afectarea hepatică mediată imun, în special hepatotoxicitatea idiosincrazică indusă de medicamente (iDILI). Studiul a fost realizat pe baza co-culturii organoide–limfocite CD8⁺ provenite de la același donator, pentru a reproduce cât mai fidel dinamica imună și citotoxică care apare la pacienți cu susceptibilitate genetică specifică, precum purtătorii alelei HLA-B*57:01.
Hepatotoxicitatea mediată de sistemul imun, inclusiv în reacțiile adverse la imunoterapii oncologice sau în hepatita autoimună, implică mecanisme adaptative dificil de reprodus în modelele preclinice existente. În special, iDILI este o cauză frecventă de retragere a medicamentelor de pe piață și de avertismente din partea autorităților de reglementare, fiind responsabilă pentru o proporție semnificativă a cazurilor de insuficiență hepatică acută. Limitările actualelor modele in vitro derivă din incapacitatea lor de a reproduce prezentarea antigenică și activarea limfocitelor CD8⁺ în contexte restrânse de HLA – mecanisme esențiale pentru patogeneza iDILI.

Deși tehnologiile bazate pe hepatocite derivate din celule stem pluripotente induse (iPSC) sau "liver-on-chip" au adus îmbunătățiri în simularea metabolismului hepatic și a imunității înnăscute, modelele existente nu recapitulează specificitatea antigenică și funcțiile efectorii adaptative. Pentru a depăși aceste limitări, autorii au creat o platformă de organoide hepatice (HLO) microaranjate, integrate cu limfocite CD8⁺ autologe, capabilă să redea complexitatea și specificitatea răspunsurilor imune umane.

Despre studiul actual

Organoide hepatice fără matrice: formare uniformă și scalabilă

Folosind sistemul Gri3D, cercetătorii au obținut organoide hepatice din celule iPSC diferențiate în stadiul de intestin anterior posterior. Agregarea celulară forțată în microcavități de 500 µm a permis formarea unor organoide omogene (~250 celule per cavitate), diferențiate printr-un protocol standardizat cu factori de creștere. Comparativ cu culturile tradiționale în Matrigel, sistemul Gri3D a oferit:

• o variabilitate mai redusă a diametrului și numărului organoizilor (coeficient de variație mai mic);
• expresia similară a markerilor hepatocitari maturi (ALB, RBP4, TTR, etc.);
• niveluri comparabile de secreție de albumină;
• prezența tuturor liniilor celulare hepatice (hepatocite, celule stelate, colangiocite, celule endoteliale).

Capacitatea platformei de a detecta toxicitate intrinsecă

Platforma a fost testată cu două medicamente:

• Chlorpromazină – toxicitate hepatică intrinsecă: a indus moarte celulară dependentă de doză (IC₅₀ = 14,4 µM), reducerea viabilității și scăderea secreției de albumină;
• Flucloxacilină – fără toxicitate intrinsecă: nu a indus nicio modificare semnificativă până la concentrații de 1 mM (peste 30x Cmax clinic).

Testările au fost repetate pe trei donatori independenți, confirmând reproducibilitatea și capacitatea platformei de a detecta variabilitatea interindividuală în toxicitate.

Integrarea limfocitelor CD8⁺ autologe: competență imună funcțională

Platforma a fost îmbunătățită prin co-culturarea HLO-urilor cu limfocite CD8⁺ autologe sau alogenice. Rezultatele au arătat:

• În co-culturi alogeneice (cu nepotrivire HLA), activarea TCR a dus la moarte hepatocitară, scăderea albuminei și eliberare de Granzyme B;
• În co-culturi autologe, nu a fost observată citotoxicitate semnificativă în absența stimulării TCR, demonstrând specificitatea imună și relevanța fiziologică a modelului.

Modelarea hepatotoxicității HLA-B*57:01-mediate de flucloxacilină

Studiul a continuat cu izolarea limfocitelor CD8⁺ și monocitelor din sângele a 8 donatori (4 purtători HLA-B*57:01 și 4 non-purtători). Monocitele au fost diferențiate în celule dendritice, care au fost încărcate cu flucloxacilină pentru a stimula specific limfocitele CD8⁺. Rezultatele au arătat că:

• 2 dintre cei 4 purtători HLA-B*57:01 au prezentat un răspuns robust la priming (activare, proliferare, expresia markerilor CD69, CD137, CD107a);
• non-purtătorii nu au prezentat activare semnificativă;
• există o variabilitate individuală majoră chiar și în cadrul purtătorilor de risc genetic.

Răspunsul citotoxic în co-cultură: recapitulează leziunea hepatică mediată imun

Limfocitele CD8⁺ primate cu flucloxacilină de la purtători HLA-B*57:01 au fost co-cultivate cu HLO-uri autologe expuse anterior la flucloxacilină (100 µM, 72h). Observațiile au fost:

• Doar donatorii responsivi HLA-B*57:01 au indus moarte hepatocitară semnificativă (4x DRAQ7+), eliberare de CK-18, TNF-α și Granzyme B;
• Donatorii non-responsivi și non-purtătorii nu au indus leziuni hepatice;
• Modelul a reprodus cu acuratețe variabilitatea clinică a răspunsului la flucloxacilină.

Concluzii

Această platformă experimentală reprezintă un pas major în modelarea in vitro a toxicității hepatice mediate imun, integrând specificitatea antigenică, compatibilitatea HLA și funcționalitatea adaptativă într-un sistem complet uman și standardizat.

Printre avantajele cheie se numără:

• modelarea funcțională a alelelor de risc (ex. HLA-B*57:01);
• scalabilitate și reproductibilitate datorită arhitecturii fără matrice și microcavităților predefinite;
• recapitulează ambele tipuri de toxicitate: intrinsecă (ex. chlorpromazină) și idiosincrazică (ex. flucloxacilină);
• permite evaluarea variabilității între donatori și dezvoltarea de teste funcționale personalizate pentru predicția riscurilor.

În concluzie, platforma oferă o infrastructură esențială pentru imunotoxicologie personalizată, fiind aplicabilă și altor forme de leziuni hepatice mediate imun, inclusiv hepatitele autoimune sau reacțiile adverse la imunoterapii oncologice. Studiile viitoare vor extinde diversitatea donatorilor, vor automatiza procesul și vor încorpora profilări transcriptomice pentru o înțelegere mai profundă a răspunsurilor imune interindividuale.