SeeDB-Live: o metodă pentru transparentizarea țesuturilor vii și imagistica profundă a organelor

Un studiu realizat în domeniul neurobiologiei și al microscopiei avansate a dezvoltat o metodă inovatoare pentru transparentizarea țesuturilor vii de mamifere, fără a compromite funcțiile celulare. Cercetarea publicată în jurnalul Nature Methods arată că un mediu bazat pe albumină serică bovină poate reduce dispersia luminii și poate crește semnificativ adâncimea imagistică în microscopie fluorescentă, facilitând observarea proceselor biologice în organe vii.

Idei principale

• Opacitatea țesuturilor biologice limitează imagistica în profunzime prin microscopie fluorescentă.
• Cercetătorii au dezvoltat SeeDB-Live, un mediu de clarificare optică compatibil cu țesuturi vii.
• Metoda se bazează pe potrivirea indicelui de refracție între mediul extracelular și citozol.
• Albumina serică bovină permite această potrivire fără a afecta funcțiile celulare.
• SeeDB-Live a crescut semnificativ adâncimea imagistică în sferoizi, organoizi, felii cerebrale și creierul șoarecilor in vivo.
• Activitatea neuronală, proprietățile electrofiziologice și comportamentul animalelor au rămas intacte.

Context

Țesuturile biologice sunt în mod natural opace deoarece structurile interne prezintă diferențe ale indicelui de refracție, ceea ce determină dispersia luminii. Această proprietate limitează sever capacitatea microscopiei optice de a observa structuri profunde în organe vii.

Pentru a depăși această problemă au fost dezvoltate mai multe tehnici:

• Microscopia cu doi fotoni, care utilizează lumină în infraroșu apropiat pentru a reduce dispersia.
• Optica adaptivă, care corectează distorsiunile optice produse de țesuturi.
• Metodele de clarificare optică, utilizate mai ales pentru țesuturi fixate.

Deși metodele de clarificare optică sunt foarte eficiente pentru probe fixate, ele folosesc adesea substanțe toxice pentru celulele vii sau soluții cu osmolaritate extrem de ridicată. În consecință, până în prezent nu existau metode capabile să facă țesuturi vii de mamifere transparente fără a perturba funcțiile fiziologice.

Despre studiu

Conceptul de potrivire a indicelui de refracție

Cercetătorii de la Universitatea Kyushu au pornit de la ipoteza că dispersia luminii poate fi redusă dacă indicele de refracție al mediului extracelular este apropiat de cel al citozolului. Această strategie ar permite propagarea luminii prin țesut cu mai puține deviații.

Testele inițiale au arătat că celulele vii devin cele mai transparente atunci când mediul extracelular are un indice de refracție de aproximativ 1,363–1,369, valoare apropiată de cea a citoplasmei.

Screeningul substanțelor candidate

Pentru a obține această potrivire a indicelui de refracție în condiții fiziologice, cercetătorii au analizat diferite substanțe:

• substanțe permeabile membranelor celulare (glicerol, dimetilsulfoxid);
• substanțe impermeabile cu masă moleculară mare (polimeri, agenți de contrast iodurați).

Testele funcționale au demonstrat că substanțele permeabile inhibă răspunsurile celulare, inclusiv semnalizarea calciului. În schimb, anumite molecule mari impermeabile, precum iodixanolul sau polimerii sferici, au păstrat funcțiile celulare intacte.

Identificarea albuminei ca agent optim

Analiza osmolarității a arătat că majoritatea polimerilor cresc foarte mult osmolaritatea mediului. În schimb, albumina serică bovină (BSA) prezintă:

• osmolaritate extrem de scăzută;
• solubilitate foarte mare în apă;
• toxicitate minimă pentru celulele mamiferelor.

Pe baza acestor proprietăți, cercetătorii au dezvoltat mediul SeeDB-Live, care conține:

• 15–17% albumină serică bovină;
• indice de refracție 1,363–1,366;
• osmolaritate fiziologică (230–340 mOsm/kg);
• concentrații ajustate de calciu și magneziu.

Rezultate

Creșterea adâncimii imagisticii în structuri multicelulare

Aplicarea SeeDB-Live a crescut semnificativ transparența structurilor multicelulare, inclusiv:

• sferoizi celulari;
• organoizi intestinali;
• organoizi corticali.

În sferoizi, semnalele fluorescente detectabile au crescut de la aproximativ 100 μm la aproximativ 250 μm adâncime. În plus, semnalele provenite din zonele profunde au devenit mai luminoase și mai ușor de detectat.

Clarificarea felilor acute de creier

Perfuzarea felilor cerebrale cu SeeDB-Live a produs clarificarea țesutului în aproximativ 30 de minute.

În aceste probe:

• adâncimea imagistică a crescut de aproximativ două ori în microscopie confocală și cu doi fotoni;
• structurile neuronale și rețelele de fibre au devenit mult mai vizibile;
• raportul semnal-zgomot al imaginilor a crescut semnificativ.

Menținerea funcțiilor neuronale

Pentru a verifica siguranța metodei, cercetătorii au analizat proprietățile electrofiziologice ale neuronilor.

Rezultatele au arătat că:

• potențialul de repaus neuronal a rămas neschimbat;
• frecvența potențialelor de acțiune a fost similară cu cea observată în condiții normale;
• activitatea sinaptică spontană a fost păstrată.

De asemenea, imaginile de calciu au confirmat că neuronii își păstrează răspunsurile fiziologice spontane și evocate.

Imaging cerebral in vivo

Metoda a fost testată și în creierul șoarecilor vii. După craniotomie și perfuzie cu SeeDB-Live, albumina a difuzat în cortex până la aproximativ 500 μm adâncime.

Consecințele au fost semnificative:

• luminozitatea neuronilor corticali a crescut de până la 3 ori la adâncimi de 600–800 μm;
• dendritele și spinele dendritice au devenit vizibile;
• răspunsurile neuronale la stimuli vizuali au rămas intacte.

Evaluarea toxicității

Analizele comportamentale au demonstrat că tratamentul cu SeeDB-Live nu afectează:

• activitatea locomotorie;
• funcțiile motorii;
• consumul alimentar.

De asemenea, nu au fost observate semne de inflamație cerebrală sau modificări structurale ale neuronilor și microgliei.

Concluzii

Studiul introduce SeeDB-Live, o metodă eficientă pentru transparentizarea țesuturilor vii de mamifere prin potrivirea indicelui de refracție între citozol și mediul extracelular. Utilizarea albuminei serice bovine permite această clarificare optică fără a afecta funcțiile celulare sau fiziologia neuronală.

Metoda permite:

• imagistica profundă a organoizilor și țesuturilor vii;
• observarea activității neuronale în creierul intact;
• extinderea tehnicilor de microscopie optică convențională la adâncimi mult mai mari.

Prin integrarea acestei abordări cu microscopie avansată și indicatori fluorescenti moderni, cercetarea deschide noi posibilități pentru studierea dinamicii biologice la scară tisulară și organică, atât ex vivo cât și in vivo.