Diagnosticul de laborator al bolilor infectioase

Cultura microbiana

Cultivarea patogenilor se face prin plasarea acestora intr-un mediu nutritiv, care sa le permita multiplicarea. Succesul acestei metode depinde de corectitudinea procedeului de recoltare si transport al probei biologice. Atunci cand exista dubii in privinta modalitatii corecte de recoltare, clinicianul  va cere sfatul laboratorului de microbiologie.

Un mediu de cultura artificial, realizat in laborator este format dintr-o substanta suport = agar (geloza sau jeleu), care nu este metabolizata de bacterii, dintr-o substanta nutritiva care intretine multiplicarea patogenilor si din substante cu rol in inhibarea cresterii altor microorganisme; ,,bulionul’’ astfel preparat  este asezat pe placile de cultura fabricate dintr-o sticla  speciala. Dupa caz, pot fi cutivate toate bacteriile din proba biologica sau, prin utilizarea substantelor antimicrobiene, pot fi selectate pentru crestere, doar acele bacterii considerate a fi implicate in producerea infectia. Dupa pregatirea si insamantarea mediului de cultura acesta este supus procesului de incubatie. Iar dupa formarea coloniilor bacteriene, placile de cultura vor fi analizate pentru indentificarea bacteriilor patogene.

Agentii virali pot fi de asemenea, izolati prin cultura, atunci cand nu putem pune in evidenta prezenta anticorpilor serici sau modificarea titrului  acestora (variatia concentratiei de anticorpi), ca urmare a unei infectii. Pentru amplificarea si detectarea virusului se utilizeaza o cultura de celule etalate intr-un singur strat, provenite de la un mamifer; aceste celule sunt astfel alese incat sa poata fi infectate de agentul viral suspectat. Celulele animale din cultura permit replicarea virala (pentru inmultire, un virus are nevoie de o gazda vie). Ulterior, virusul va fi detectat datorita efectelor citopatice asupra celulelor din cultura sau cu ajutorul metodei imunofluorescente. Un virus care se raspandeste rapid de la o celula la alta (virusul citomegalic, herpes simplex) poate fi detectat mult mai usor intr-o astfel de  cultura.

METODE  DE  IDENTIFICARE  A  AGENTILOR  PATOGENI  CULTIVATI

Rezultatul insamantarii si incubarii placilor de cultura, il reprezinta formarea coloniilor bacteriene, favorizata de existenta mediului nutritiv artificial creat. Pasul urmator il reprezinta identificarea patogenilor care au format colonii. Identificarea se face tinand cont de caracterele fenotipice: dimensiunea coloniilor, culoarea coloniilor, reactia de hemoliza (liza a eritrocitelor), mirosul. De asemenea, se va tine cont de posibilitatea unor bacterii de a forma prin cultivare produsi finali specifici, dar si de aspectul microscopic al acestora.

Sistemele automatizate pot identifica patogenii, pe baza caracteristicilor fenotipice, in cateva ore (biotipare automata). Pentru accelerarea procesului de identificare, unele sisteme utilizeaza enzime performante, capabile sa converteasca substratul analizat in  produse finale mai usor de identificat.

Cromatografia cu gaz-lichid este utilizata pentru identificarea produsilor finali, rezultati in urma procesului de fermentatie bacteriana. Procedeul permite identificarea acizilor grasi cu lant scurt rezultati in urma precesului de fermentatie a glucozei. Tipurile de acizi volatili si concentratia acestora difera functie de specia de microorganism anaerob care realizeaza fermentatia, permitand identificarea chiar si a speciilor strans inrudite. Rezultatele pot fi obtinute in decurs de cateva ore dupa formarea coloniilor. Metoda cromatografica de analiza a acizilor grasi cu lant lung este una dintre cele mai utilizate in laboratorul de microbiologie, pentru caracterizarea fenotipica a patogenilor.

Sondele de acizi nucleici permit diagnosticul infectiilor bacteriene, virale sau fungice, pe baza detectiei secventelor de ADN / ARN specifice patogenilor.

Tehnica consta in punerea in evidenta a unei secvente scurte de ADN / ARN bacterian prin cuplarea cu o molecula complementara, utilizata ca semnal pentru detectie. Procedeul implica liza celulelor bacteriene, urmata de denaturarea prin caldura a lanturilor de ADN / ARN cu obtinerea de molecule monocatenare (ADN-ul este in mod normal dublu catenar = format din doua lanturi de nucleotide complementare). Dupa ce ,,sonda’’ a hibridizat cu molecula tinta de ADN mococatenar, se folosesc diferite tehnici pentru detectarea si amplificarea semnalului biologic sonda-ADN monocatenar. Unele sonde permit  identificarea ADN-ului bacterian iar altele pe cel de origine virala (papilloma virus).
Sensibilitate si specificitatea metodelor ce utilizeaza sondarea cu acizi nucleici este comparabila cu cea a metodelor traditionale (culturi sau EIA). Pentru o mai buna acuratete a rezultatelor, atat ADN-ul tinta cat si sondele, pot fi amplificate prin metodele de polimerizare in lanta (PCR). Metoda are anumite limite, deoarece in timpul procesului de amplificare se poate face contaminarea cu ADN sau ARN provenit din alte surse bacteriene sau virale, care va conduce la obtinerea unor rezultate fals pozitive.

Tehnica de sondare cu acizi nucleici este foarte utila in identificarea unor specii bacteriene cu crestere dificila, cum ar fi speciile de Mycobacterium (agentul etiologic al tuberculozei). De asemenea, agentii virali pot fi identificati mult mai repede decat prin metodele de cultivare ,,in vitro’’. Datorita costurilor ridicate si a echipamentului complex (in comparatie cu metodele clasice), procedeul de indetificare a ADN / ARN-ului patogen nu poate fi aplicat in toate laboratoarele de microbiologie.