ADN-ul „junk” ar putea conține noi indicii despre boala Alzheimer

Un studiu realizat pe astrocite umane primare și publicat în jurnalul Nature Neuroscience a investigat modul în care regiunile amplificator controlează expresia genelor în aceste celule gliale. Cercetarea arată că analizarea directă a funcției amplificatorilor în locusul lor genomic nativ poate dezvălui circuite de reglare transcripțională specifice, inclusiv interacțiuni relevante pentru boala Alzheimer.
Screeningurile CRISPR cu citire a expresiei genice au permis investigarea funcției amplificatorilor în linia celulară K562 și, la scară mai mică, în celulele T, neuronii derivați din celule stem pluripotente induse sau în experimente de tip reporter. Deși aceste studii au generat hărți funcționale utile, puține date existau până acum despre modul în care amplificatorii controlează expresia genelor în astrocitele umane primare, celulele gliale cele mai numeroase din creier, esențiale pentru susținerea și modularea funcției neuronale. Prin urmare, explorarea directă a acestor mecanisme în astrocite oferă un cadru necesar pentru înțelegerea reglării transcripționale specifice acestui tip celular și a implicațiilor sale în neurodegenerare.

Despre studiu

Selecția și caracterizarea amplificatorilor

Cercetătorii au folosit astrocite umane primare provenite din creier fetal și au confirmat că aceste celule își păstrează identitatea fetală atât transcriptomic, cât și epigenomic. Au fost selectate 979 de regiuni candidate de tip amplificator din baza de date PsychENCODE, toate aflate în afara genelor și situate la mai mult de 2 kilobaze de orice transcripție cunoscută. Regiunile au trebuit să fie într-o stare deschisă a cromatinei în astrocite și în cel puțin două seturi suplimentare de date ATAC-seq din alte tipuri gliale. De asemenea, fiecare regiune trebuia să se afle într-un domeniu topologic asociat care să conțină cel puțin o genă exprimată puternic în astrocite.

Analiza a arătat că regiunile candidate erau puternic îmbogățite pentru amplificatori distali (raport de șanse 43,8) și depletate pentru promotori sau amplificatori proximali. Majoritatea (61%) erau accesibile atât în astrocitele fetale, cât și în cele adulte. Folosind date single-nucleus ATAC-seq din creierul uman au fost identificate șase module de co-accesibilitate, dintre care 86% erau specifice astrocitelor sau altor celule gliale.

Screeningul CRISPRi

A fost construită o bibliotecă cu 2.478 ghiduri CRISPRi care au acoperit cei 979 de amplificatori. Celulele au fost transduse la un indice de multiplicare scăzut, iar după șapte zile s-a efectuat secvențiere la nivel de celulă unică, obținându-se 47.577 celule de calitate înaltă și o medie de 52.472 de transcripte unice per celulă. Fiecare amplificator a fost analizat în medie în 327 de celule.

Expresia genică a fost comparată între celulele țintite și cele ne-țintite, evaluând gene situate în interiorul unei ferestre de 500 kilobaze în jurul fiecărui amplificator. Semnificația statistică a fost stabilită printr-un prag al ratei empirice de descoperire falsă mai mic de 0,1.

Interacțiuni amplificator–gen identificate

Screeningul a identificat 145 de amplificatori funcționali care reglează expresia a 116 gene, rezultând 158 interacțiuni amplificator–gen. Aproximativ 84% dintre aceste relații au dus la scăderea expresiei genice, iar modificarea medie absolută a fost de 0,22 fold change log2. Majoritatea amplificatorilor au controlat o singură genă, iar majoritatea genelor au fost influențate de un singur amplificator, însă au existat și situații cu reglare complexă în care până la cinci amplificatori au afectat aceeași genă.

Validarea independentă prin NanoString a confirmat 18 din 20 interacțiuni testate (90%), iar o testare suplimentară prin qRT-PCR a confirmat efectele în 6 din 7 cazuri. Un experiment imunoblot pentru FTH1 a arătat că suprimarea unui amplificator specific a redus nivelul proteinei cu 24%.

Proprietățile amplificatorilor funcționali

• Distanța până la genele țintă: 76% dintre interacțiuni au avut loc în intervalul 200 kilobaze, iar 50% în intervalul 50 kilobaze.
• Corespondență cu cea mai apropiată genă: doar 38,6% dintre interacțiuni au implicat gena cea mai apropiată; unele au „ocolit” până la 34 gene.
• Transcrierea amplificatorilor: 73,1% dintre amplificatorii funcționali au prezentat transcriere detectabilă prin TT-seq, cu orientare predominant bidirecțională.
• Specificitate epigenomică: 48% au variat între tipuri celulare, 4% între stadii de dezvoltare și 34% între ambele.

Rețele de reglare transcripțională

Analiza îmbinată a amprentelor de legare pentru factori de transcripție, a datelor CRISPRi și a datelor single-cell a permis construirea unei rețele de reglare specifice astrocitelor. Au fost identificați 36 factori de transcripție cu potențial rol direct asupra amplificatorilor funcționali, inclusiv membri ai complexului AP1 (FOS și JUN), asociați în mod cunoscut cu activarea astrocitelor.

Pentru 33 dintre interacțiunile predicție TF–amplificator au existat date ChIP-seq adecvate, iar 72% au fost confirmate, întărind validitatea rețelei. Douăzeci de amplificatori au fost identificați ca fiind specifici astrocitelor și legați de gene critice pentru funcțiile acestora.

Legătura cu boala Alzheimer

Genele reglate de amplificatorii funcționali au fost îmbogățite pentru gene implicate în tulburări ale sistemului nervos central, în special în boala Alzheimer. Un total de 100 dintre cele 158 de interacțiuni sunt asociate cu trăsături neuropatologice sau cognitive legate de această afecțiune.

Un exemplu este LGALS3, o genă implicată în interacțiunea astrocite–microglie și modularea efectelor variantei APOE4. Trei amplificatori controlați LGALS3, doi dintre ei fiind specifici astrocitelor. Validarea prin NanoString a confirmat toate aceste trei interacțiuni.

Variantă genetică și funcția amplificatorilor

Compararea rezultatelor CRISPRi cu bazele de date eQTL a arătat că doar 17% dintre interacțiuni sunt captate de analizele eQTL existente. Mai mult, 40% dintre amplificatori erau asociați, prin eQTL, cu gene diferite de cele identificate funcțional prin CRISPRi.

Analiza variantelor din proiectul de secvențiere pentru boala Alzheimer a arătat că 57% dintre amplificatorii funcționali conțin variante asociate bolii. Un exemplu este un amplificator al genei CCL2, unde scorurile predictive de impact sugerează variante cu relevanță patogenică.

Modelare predictivă a interacțiunilor amplificator–gen

Cercetătorii au dezvoltat un model de pădure aleatorie numit EGrf, care a depășit modelele existente în predicția interacțiunilor funcționale. Modelul a fost apoi aplicat întregului genom pentru regiunile de cromatină deschisă, generând 1.348 interacțiuni precise cu înaltă specificitate. Validarea experimentală a 5 dintre acestea a confirmat 4.

Rezultate

Studiul a reușit să definească la nivel funcțional un peisaj extins al amplificatorilor în astrocite, oferind o hartă detaliată a interacțiunilor amplificator–gen validate experimental. Rezultatele cheie includ:

• Identificarea a 158 interacțiuni amplificator–gen confirmate, dintre care multe sunt relevante pentru gene alterate în boala Alzheimer.
• Caracterizarea epigenomică detaliată a amplificatorilor funcționali, incluzând transcrierea, dinamica dezvoltării și specificitatea de tip celular.
• Construirea unei rețele de reglare transcripțională specifice astrocitelor.
• Arătarea faptului că analizele eQTL nu reușesc să surprindă majoritatea interacțiunilor funcționale identificate.
• Dezvoltarea unui model predictiv performant care extinde această hartă la nivelul întregului genom.

Împreună, aceste descoperiri oferă resurse esențiale pentru înțelegerea modului în care regiunile noncodante controlează expresia genică în astrocite și pentru interpretarea variantelor genetice implicate în neurodegenerare.