O boală ereditară rară crește riscul de cancer și împiedică repararea ADN-ului deteriorat prin chimioterapie

Un studiu publicat recent de o echipă internațională de cercetători în Nature Communications identifică o nouă cale de reparare a rupturilor duble de ADN (DSBs), implicând nucleatorul de actină DIAPH1 și actina de tip γ. Lucrarea propune redefinirea sindromului cunoscut anterior ca SCBMS într-o entitate clinică distinctă, denumită DIAL (DIAPH1 Sindromul de pierdere a funcției și demonstrează rolul critic al acestei proteine în menținerea stabilității genomice.
Actina este o proteină esențială a citoscheletului, prezentă în celulele mamifere sub două forme ubiquitare: β-actină și γ-actină. Deși extrem de similare la nivel de secvență, cele două izoforme participă diferențiat la procese precum migrarea celulară, diviziunea celulară sau fagocitoza. Nuclearea filamentelor de actină este reglată de trei familii majore de proteine: Arp2/3, formin și Spire, fiecare contribuind la diferite tipuri de organizare a filamentelor.

DIAPH1 este un membru al familiei forminelor activate de GTPaze de tip Rho și este implicat în organizarea filamentelor de actină γ. Mutanții activatori ai acestei proteine au fost anterior asociați cu pierdere de auz și trombocitopenie. Recent, au fost identificate mutații inactivatoare bialelice ale DIAPH1 în sindroame neurodezvoltamentale severe, cu trăsături clinice similare celor observate în sindroamele de instabilitate cromozomială, precum NBS sau WABS.

Despre studiu

Cercetătorii au identificat și caracterizat o serie de pacienți (>30) purtători de mutații bialelice inactivatoare în DIAPH1, toți prezentând microcefalie, dizabilitate intelectuală, convulsii, infecții recurente și tulburări de vedere. Analizele de tip whole exome sequencing și Western blot au confirmat absența expresiei proteinei DIAPH1 în aceste cazuri.

Pentru a determina rolul acestei proteine în repararea ADN-ului, cercetătorii au efectuat:

• teste de expunere la radiații ionizante (RI), camptotecină (CPT) și etopozid (ETOP);
• analize de foci γ-H2AX și 53BP1 pentru a evalua eficiența reparării DSBs;
• cuantificarea micronucleilor și a aberațiilor cromozomiale;
• studii de complementare cu DIAPH1 de tip sălbatic sau mutanți inactivi în nuclearea actinei;
• experimente de rezecție a capetelor DSB prin urmărirea complexului MRN (MRE11-RAD50-NBS1);
• teste CRISPR pentru eficiența recombinării homoloage (RH) la loci endogeni și în sisteme raportor.

Rezultate

1. Sindromul DIAL: o nouă entitate clinică

Mutațiile bialelice ale DIAPH1 sunt asociate cu un spectru clinic distinct, denumit DIAL syndrome. Pacienții nu au trăsăturile tipice SCBMS, dar prezintă defecte severe de dezvoltare neurologică și imunodeficiență. Aproximativ 75% din mutații sunt frameshift sau nonsense, determinând absența completă a proteinei.

2. DIAPH1 este esențial pentru repararea rupturilor duble de ADN

Celulele deficient în DIAPH1 prezintă acumulări persistente de γ-H2AX post-RI și CPT/ETOP. Complemetarea cu DIAPH1 sălbatic restabilește capacitatea de reparare a ADN-ului. Micronucleii și aberațiile cromozomiale cresc semnificativ în absența DIAPH1. Sensibilitatea crescută la RI nu este explicată de alterări ale ciclului celular sau de o activare deficitară a ATM.

3. Defectul este specific căii RH, nu NHEJ

Deficiența DIAPH1 afectează RH în faza G2, dar nu repararea prin NHEJ în G1. Testele de schimb de cromatide surori și inserție CRISPR mClover indică o reducere semnificativă a eficienței RH. DIAPH1 este necesar pentru recrutarea BRCA1, RPA2 și RAD51 la DSB-uri.

4. DIAPH1 facilitează rezecția capetelor DSB prin MRN

În absența DIAPH1, relocalizarea MRE11 la DSB este profund afectată. Analizele STORM și testele cu FokI confirmă defectul de recrutare al MRN. DIAPH1 interacționează fizic cu MRE11 și RAD51, iar lipsa sa reduce formarea ADN monocatenar (ssDNA).

5. Implicarea specifică a γ-actinei și complexului Arp2/3

Doar mutațiile în ACTG1 (γ-actină), nu ACTB (β-actină), sunt asociate cu defecte DSBR. DIAPH1 se leagă selectiv de γ-actină și necesită această interacțiune pentru funcția de reparare. Mutantul I862A de DIAPH1, inactiv în nuclearea actinei, nu poate corecta defectul DSBR. Mutațiile în ARPC1B, ARPC4 și ARPC5 (componente Arp2/3) afectează sever DSBR.

6. Un mecanism molecular colaborativ: DIAPH1 – Arp2/3 – γ-actină

Depleția combinată a DIAPH1, γ-actinei și Arp2/3 nu are efect aditiv, sugerând o cale comună. Aceste componente sunt necesare pentru recrutarea MRN și formarea foci RAD51. Eficiența RH (măsurată prin mClover-LMNA) este semnificativ redusă când oricare dintre aceste componente este absentă.

Concluzii

• Studiul identifică sindromul DIAL ca o nouă tulburare de instabilitate genomică caracterizată prin defecte în RH și predispoziție la limfoame.
• DIAPH1 este esențial pentru RH prin promovarea recrutării și stabilizării complexului MRN și a filamentelor de γ-actină la locul DSB-urilor.
• Spre deosebire de mutațiile în BRCA1/2, deficiența DIAPH1 nu sensibilizează celulele la inhibitori PARP, indicând mecanisme distincte.
• Rezultatele susțin un nou model în care nuclearea filamenteleor de γ-actină de către DIAPH1 și colaborarea cu Arp2/3 contribuie la stabilitatea genomică prin RH.

Implicații viitoare

• DIAPH1 ar putea reprezenta o țintă de diagnostic genetic în cazuri de microcefalie, imunodeficiență și instabilitate cromozomială inexplicabilă.
• Este necesară investigarea impactului acestor descoperiri asupra răspunsului la terapii genotoxice și posibilitățile de tratament țintit în cancere cu mutații în DIAPH1.
• Studiul oferă o nouă paradigmă asupra rolului nucleoscheletului în repararea ADN și deschide calea către identificarea de noi factori de vulnerabilitate terapeutică în oncologie.