Un nou mecanism molecular care explică sensibilitatea crescută a sarcomului Ewing la medicamentele ce inhibă topoizomeraza I (TOP1), cum este irinotecanul

Un studiu publicat în iulie 2025 în revista Oncogene de o echipă de la Universitatea din Sevilla, Spania, în colaborare cu grupuri din Germania și Italia, a elucidat un nou mecanism molecular care explică sensibilitatea crescută a sarcomului Ewing la medicamentele ce inhibă topoizomeraza I (TOP1), cum este irinotecanul. Studiul oferă o perspectivă originală asupra rolului fuziunii oncogenice EWS::FLI1 în modularea stresului replicativ și a instabilității genomice prin controlul metabolismului structurilor R-loop.

Context

Sarcomul Ewing (EwS) este o tumoare malignă a țesuturilor osoase și moi, predominant pediatrică, caracterizată printr-o translocație specifică între genele EWSR1 și FLI1, prezentă în circa 85% din cazuri. Această fuziune produce proteina chimerică EWS::FLI1, principalul factor oncogenic implicat în transformarea celulară și menținerea fenotipului malign.

Deși pacienții cu boală localizată au o rată de supraviețuire la 5 ani de 70–80%, cei cu metastaze la diagnostic ating doar 30% supraviețuire pe termen lung. Chimioterapia standard (regimul VDC/IE – vincristină, doxorubicină, ciclofosfamidă alternând cu ifosfamidă și etoposid) rămâne baza tratamentului, dar recurențele și rezistența la terapie sunt frecvente.

În ultimul deceniu, combinația irinotecan-temozolomidă a arătat eficacitate în formele refractare, sugerând o sensibilitate particulară a sarcomului Ewing la inhibitori ai topoizomerazei I. Totuși, mecanismele moleculare din spatele acestei sensibilități au rămas insuficient clarificate.

Anterior, s-a demonstrat că fuziunea EWS::FLI1 determină acumularea de structuri R-loop (hibride ADN-ARN care se formează în timpul transcripției), generând un fenotip asemănător deficienței de recombinare omoloagă (BRCAness). Aceste structuri, dacă nu sunt rezolvate corespunzător, provoacă stres replicativ și instabilitate genomică.

Helicaza DHX9 (RNA helicase A) are un rol central în metabolismul R-loop-urilor, fiind implicată atât în formarea, cât și în eliminarea acestora, în funcție de contextul celular. Ea interacționează direct cu EWS::FLI1, acționând ca un cofactor transcripțional al său.

Despre studiul actual

Cercetătorii au investigat modul în care interacțiunea dintre EWS::FLI1 și DHX9 influențează sensibilitatea celulelor de sarcom Ewing la SN-38, metabolitul activ al irinotecanului.

Pentru aceasta, au utilizat:

• Linii celulare izogenice de sarcom Ewing cu expresie controlabilă a fuziunii EWS::FLI1 printr-un sistem shRNA inductibil cu doxiciclină.

• Teste in vitro și in vivo pentru a evalua efectele citotoxice ale SN-38 și acumularea de leziuni ADN (marker γ-H2AX).

• Analize moleculare ale metabolismului R-loop-urilor (folosind sondele S9.6) și ale interacțiunilor proteice (imunoprecipitare, ChIP, și analiza complexelor DHX9–RNAPII).

• Supraproducerea RNase H1 (enzimă care degradează ARN-ul din R-loop-uri) pentru a determina rolul direct al acestor structuri în inducerea leziunilor ADN.

Rezultatele au fost coroborate cu analize de expresie și date clinice din cohorte publice (cBioPortal), pentru a evalua semnificația prognostică a nivelurilor DHX9 la pacienții cu EwS.

Rezultate

1. Sensibilitatea la topoizomeraza I este dependentă de fuziunea EWS::FLI1

Celulele de sarcom Ewing au prezentat o hipersensibilitate marcată la SN-38 comparativ cu alte sarcoame. Reducerea expresiei EWS::FLI1 a indus rezistență la tratament, fără a modifica rata de proliferare, replicare ADN sau transcripție globală.

Acest fapt sugerează că EWS::FLI1 determină un mecanism specific de sensibilizare la leziunile induse de inhibarea topoizomerazei I, independent de procesele proliferative.

2. SN-38 induce acumularea de R-loop-uri în mod EWS::FLI1-dependent

Expunerea la SN-38 a determinat o creștere semnificativă a structurilor R-loop în celulele EwS, efect absent în sarcoamele fără fuziunea EWS::FLI1.
Supraexprimarea RNase H1 a redus leziunile ADN induse de SN-38, confirmând că R-loop-urile sunt mediatorii principali ai instabilității genomice în acest context.

3. EWS::FLI1 „sechestrează” DHX9, împiedicând rezoluția R-loop-urilor

Analizele de interacțiune au arătat că EWS::FLI1 formează un complex stabil cu DHX9 și ARN polimeraza II (RNAPII) în timpul elongării transcripționale.
Această interacțiune împiedică recrutarea DHX9 către R-loop-urile formate în urma inhibării TOP1, blocând astfel mecanismele de rezoluție ale acestor structuri.

Ca urmare:

• DHX9 devine inaccesibil pentru procesarea R-loop-urilor, ducând la acumularea lor excesivă.

• Se instalează stres replicativ accentuat și rupturi ADN dublu catenare (DSBs), cu moarte celulară ulterioară.

Interesant, supraproducerea DHX9 sau inhibarea interacțiunii EWS::FLI1–DHX9 (prin molecula mică YK-4-279) a redus semnificativ citotoxicitatea SN-38. Totuși, autorii notează că YK-4-279 are limitări de specificitate, putând afecta și alte proteine ETS.

4. Nivelurile crescute de DHX9 se corelează cu prognostic mai prost

Analiza a două cohorte publice a arătat că expresia ridicată a DHX9 este asociată cu supraviețuire globală mai scurtă.
Această expresie crescută poate proveni din câștiguri cromozomiale pe brațul 1q25, observate la aproximativ 18% dintre pacienți.

5. EWS::FLI1 determină stres replicativ și instabilitate genomică

Celulele EwS tratate cu SN-38 au prezentat un model γ-H2AX difuz în nucleu, tipic pentru daunele ADN apărute în faza S. Analizele au evidențiat blocarea furcilor de replicare și reducerea progresiei replicative.

Aceste efecte au fost dependente de EWS::FLI1 și reversibile prin expresia RNase H1, confirmând că defectele în rezoluția R-loop-urilor reprezintă cauza primară a stresului replicativ.

6. Inhibarea ATR amplifică efectul topoizomerazei I

Combinarea inhibitorilor ATR (factor-cheie al răspunsului la stres replicativ) cu SN-38 a generat efecte sinergice, crescând semnificativ numărul de rupturi ADN și moartea celulară. Această combinație este propusă ca strategie terapeutică promițătoare pentru studiile preclinice viitoare.

Concluzii

Studiul demonstrează că interacțiunea EWS::FLI1–DHX9 este esențială pentru modularea sensibilității sarcomului Ewing la inhibitorii topoizomerazei I.
Fuziunea EWS::FLI1 „hijackează” helicaza DHX9, împiedicând funcția sa normală de rezoluție a R-loop-urilor. Acest fenomen duce la acumularea anormală de structuri ADN-ARN, stres replicativ, instabilitate genomică și, în final, moarte celulară indusă de SN-38.

Prin urmare:

• EWS::FLI1 acționează ca un determinant molecular al sensibilității la irinotecan, oferind o explicație pentru eficacitatea acestuia în tratamentul EwS.

• Nivelurile DHX9 ar putea reprezenta un biomarker prognostic și predictiv al răspunsului terapeutic.

• Combinarea inhibitorilor ATR cu medicamente de tip SN-38 se conturează ca o posibilă strategie de intensificare a efectului antitumoral.

În ansamblu, aceste descoperiri oferă o viziune moleculară integrată asupra vulnerabilităților terapeutice ale sarcomului Ewing și deschid calea spre terapii personalizate bazate pe semnătura EWS::FLI1–DHX9 și metabolismul R-loop-urilor.