Virusul gripal manipulează sistemul de reglare genetică a organismului pentru a-și accelera propria răspândire

Un studiu realizat de cercetători de la Universitatea din Gothenburg și publicat recent în Nucleic Acids Research a investigat un mecanism nou prin care virusul gripal A (Influenza A Virus - IAV) reușește să susțină propria replicare. Lucrarea a demonstrat că proteina nucleară AGO2, parte a complexului RISC implicat în interferența ARN (RNAi), joacă un rol esențial în reglarea răspunsului antiviral prin interferon de tip I (IFN-I).
În multe organisme eucariote, interferența ARN este un mecanism crucial de apărare antivirală. În mamifere, rolul său a fost însă controversat. Deși unele studii au sugerat existența unui efect antiviral, altele nu au găsit dovezi clare. Pe de altă parte, virusurile par să fi dezvoltat strategii pentru a exploata sistemul RNAi în avantajul lor. Virusul gripal A, prin proteina sa non-structurală NS1, este cunoscut pentru capacitatea de a inhiba răspunsurile imune ale gazdei, inclusiv prin interferența cu sistemele de recunoaștere virală bazate pe TRIM25 și RIG-I.

În paralel, s-a constatat că factorii AGO (în special AGO2) pot migra în nucleu în condiții de stres, inclusiv infecții virale. Totuși, funcția exactă a AGO2 nuclear în contextul infecțiilor virale nu era clar elucidată.

Despre studiu

Metodologie și tehnici utilizate

Studiul a combinat modele in vitro și in vivo (inclusiv șoareci C57BL/6 și linii celulare HEK293, HEK293T, A549, MCF7) pentru a examina comportamentul AGO2 în infecția cu virusul gripal A (tulpina PR8 H1N1). Printre metodele folosite:

• Biologie moleculară și celulară: infectarea celulelor cu IAV, transfectări cu plămade ADN, tratamente cu agenți chimici (doxorubicină, arsenit de sodiu).
• Analize de expresie: RT-qPCR, Western blot, imunoprecipitare, imunofluorescență, citometrie în flux.
• Tehnici avansate de secvențiere: RNA-seq, miRNA-seq, fPAR-CLIP pentru identificarea țintelor AGO2 la rezoluție de nucleotide.

Participanți și modele experimentale

• Celule umane HEK293 și HEK293T pentru studii de bază.
• Celule A549 (cancer pulmonar), MCF7 (cancer de sân), SK-N-BE(2) (neuroblastom) pentru confirmări.
• Șoareci C57BL/6 pentru validări in vivo ale efectelor observate in vitro.
• Crearea de mutanți TP53 (p53 knockout) prin CRISPR-Cas9 pentru testarea rolului p53 în translocarea AGO2.

Elemente cheie

• Plasmide pentru exprimarea proteinelor virale IAV, inclusiv variante mutate de NS1.
• Utilizarea virusului PR8-NS1-mCherry pentru urmărirea infecției în timp real.
• Inhibitori chimici pentru modificarea localizării nucleare a proteinelor.

Rezultate

Infecția cu IAV induce translocarea nucleară a AGO2

• În urma infectării celulelor HEK293 cu IAV, AGO2 a migrat din citoplasmă în nucleu într-o manieră dependentă de doza virală (multiplicity of infection - MOI ≥2).
• Proteina NS1 a fost identificată ca principalul factor viral responsabil de această translocare.
• NS1, prin domeniul său C-terminal (aa 81-225), facilitează acumularea nucleară a AGO2.

AGO2 interacționează cu p53 în nucleu în timpul infecției

• P53, un regulator cheie al stresului celular, interacționează fizic cu AGO2 în nucleu după infecția cu IAV.
• Această interacțiune necesită domeniul N-terminal al p53, bogat în triptofan, care se leagă de domeniul PIWI al AGO2.
• Forma tetramerică activă a p53 este esențială pentru stabilizarea nucleară a AGO2.

Funcția nucleară a AGO2 favorizează replicarea virală

Celulele fără p53 sau cu AGO2 inhibat au prezentat:

• Reducerea localizării nucleare a AGO2.
• Scăderea expresiei genelor virale (HA și NS1).
• Reducerea replicării virale măsurate prin citometrie în flux și teste TCID50.

Reintroducerea p53 în celulele knock-out a restaurat parțial replicarea virală și translocarea AGO2 în nucleu.

AGO2 nuclear inhibă răspunsul imun antiviral prin suprimarea interferonului de tip I

• Celulele cu AGO2 nuclear au exprimat niveluri mai scăzute de IFNB și alte gene stimulate de interferon (ISGs: ISG15, ISG20, OAS1, OAS3).
• Inhibarea nuclearizării AGO2 prin tratamente chimice sau knockdown genetic a dus la creșterea expresiei interferonului și a reducerii încărcăturii virale.
• Activitatea promotorului ISRE (element de răspuns la interferon) a fost semnificativ crescută în absența AGO2 nuclear.

Concluzii

Acest studiu aduce dovezi clare că virusul gripal A deturnează funcțiile de reglare ARN mediate de AGO2 pentru a inhiba răspunsul imun al gazdei și a-și spori replicarea. Esențial:

• Proteina NS1 a virusului redirecționează AGO2 în nucleu.
• AGO2 nuclear, stabilizat prin interacțiunea cu tetramerul p53, suprimă expresia interferonilor de tip I și a genelor asociate.
• Acest mecanism ajută virusul să ocolească răspunsurile antivirale inițiale ale gazdei.

Implicații

Descoperirea oferă noi perspective asupra strategiilor virale de evaziune imună și sugerează că perturbarea interacțiunii AGO2-p53 sau a translocării nucleare a AGO2 ar putea constitui ținte terapeutice promițătoare împotriva infecțiilor gripale severe.