Mini-intestine cultivate în laborator dezvăluie cum Shigella infectează intestinul uman

Un studiu publicat în Nature Genetics a prezentat o hartă genomică detaliată a factorilor genetici necesari colonizării intestinului uman de către Shigella flexneri. Studiul a fost realizat de cercetătorii de la Universitatea din Uppsala printr-o abordare integrativă care combină modele organoide intestinale umane, secvențiere de inserții transpozonice (TraDIS) și analiză statistică avansată, oferind o perspectivă extinsă asupra patogenezei unei bacterii exclusiv umane.
Shigella flexneri este principalul agent cauzal al dizenteriei bacilare, afectând anual milioane de persoane, în special în regiunile cu resurse limitate. Deși virulența sa este asociată cu un sistem sofisticat de secreție de tip III (T3SS) și un set de gene localizate pe un plasmid de virulență (pINV), studiile moleculare in vivo au fost limitate din cauza absenței unor modele animale adecvate care să reproducă fidel fiziologia intestinală umană.

Modelul enteroid derivat din celule stem umane, care imită fidel epiteliul intestinal, a devenit o alternativă promițătoare pentru studiul interacțiunilor gazdă-patogen. În această cercetare, autorii au utilizat enteroizi umani crescuți în suspensie (cu polaritate bazală externă) pentru a analiza, la scară largă, capacitatea de colonizare a Shigella și au dezvoltat o hartă genomică comprehensivă a genelor implicate în acest proces.

Despre studiu

Pentru a depăși provocările asociate cu eșantioanele mici (bottlenecks) și selecțiile distorsionate în timpul infecției, autorii au:

• Optimizat un model de infecție în enteroizi umani 3D, folosind o tulpină Shigella flexneri M90T raportor (puhpT-GFP).
• Aplicat tehnologia TraDIS (Transposon Directed Insertion Sequencing) pe o bibliotecă Tn5 cu aproximativ 130.000 de mutanți.
• Calculat fitness-ul fiecărui mutant utilizând un model bayesian bazat pe distribuția negativ binomială zero-inflaționată (ZINB).
• Comparat rezultatele TraDIS cu date de expresie genică (RNA-seq) și proteomică pentru a corela expresia genelor cu avantajul sau dezavantajul conferit în colonizare.

Studiul a implicat 43 de infecții paralele ale enteroizilor, cu sub-biblioteci de mutanți, fiecare conținând între 2.000 și 3.000 de mutanți. Pentru controlul efectului temperaturii asupra expresiei T3SS, au fost analizate creșteri bacteriene la 30 °C și 37 °C.

Rezultate

1. Validarea modelului de infecție

S-a demonstrat că Shigella colonizează enteroizii în mod eficient prin fața bazolaterală, cu expansiunea focarelor infecțioase între 3 și 9 ore post-infecție. Colonizarea de către tulpina ΔmxiD (mutant T3SS-deficient) a fost de peste 60 ori mai slabă decât cea a tulpinii sălbatice.

2. Impactul bottleneck-ului

Infecțiile enteroidale conțineau între 1.500 și 4.000 de mutanți unici în populația intracelulară recuperată, ceea ce corespunde unui bottleneck de ~2.000 de bacterii. Acest fapt a fost esențial pentru calibrarea modelului statistic și a designului experimental, reducând pierderile stocastice de mutanți nelegate de virulență.

3. Harta genomică a colonizării

Au fost identificate 105 gene cromozomale și 38 gene pINV necesare pentru colonizarea epitelială umană. Printre genele noi asociate colonizării s-au numărat: rpoS, iraM, pnp, gene implicate în transport (de ex. yfeH, nagE) și enzime de modificare tRNA (mnmE, mnmG). Un set de gene T3SS (inclusiv virF, virB, mxiD, ipaA, icsB, ipgD, ipgB1, virA) au fost confirmate ca esențiale.

4. Colonizare dependentă de geometrie celulară

Colonizarea enteroizilor și colonoizilor cu polaritate apicală (AO) a fost semnificativ mai slabă (~5–15 ori) comparativ cu cele cu polaritate bazală (BO). Delețiile ipgB1, ipgB2, ipaA și virA au afectat semnificativ capacitatea de invazie în AO, confirmând o dependență de contextul epitelial.

5. Control global al virulenței prin modificări tRNA

• ΔmnmE și ΔmnmG au prezentat o reducere de 6–10 ori în colonizarea enteroizilor.
• Analizele proteomice au arătat o scădere semnificativă a expresiei a peste 25 de proteine de virulență pINV, inclusiv IpaB, IpaC, IpaA, MxiC.
• Genele virulente pINV prezintă o frecvență crescută a codonilor rari AGA (arginină) și GGA (glicină), care sunt eficient traduși doar în prezența modificărilor MnmE/G ale tRNA-urilor.
• Complementarea genică cu mnmE/mnmG a restaurat atât expresia proteinei IpaA cât și capacitatea de colonizare.

Concluzii

Acest studiu definește pentru prima dată o hartă genomică completă a factorilor de colonizare ai Shigella flexneri într-un model de epiteliu intestinal uman nealterat. Prin combinarea modelelor organoide, secvențierii la scară genomică și a modelării bayesiene, cercetătorii:

• Au identificat atât gene cunoscute cât și factori noi de virulență;
• Au demonstrat un control post-transcripțional al expresiei genelor T3SS prin modificări de tRNA;
• Au evidențiat importanța contextului epitelial în eficiența invaziei bacteriene.

Studiul oferă nu doar o platformă generalizabilă pentru explorarea genomurilor patogene în infecții complexe, dar și noi ținte potențiale pentru terapii antimicrobiene. Mai mult, legătura dintre modificările codonice și reglarea globală a virulenței deschide o nouă direcție de cercetare în microbiologia moleculară a patogenilor umani.