Sinteza compușilor farmaceutici din rododendron, realizată prin bacterii E. coli modificate genetic

Un studiu experimental recent a investigat dezvoltarea unei platforme microbiene bazate pe Escherichia coli pentru producerea acidului orselinic (OSA) și a meroterpenoizilor derivați, compuși naturali cu activități farmacologice relevante. Rezultatele publicate în Metabolic Engineering arată că optimizarea metabolică și a condițiilor de cultură permite creșterea semnificativă a producției de OSA și demonstrează pentru prima dată biosinteza de novo a unui meroterpenoid derivat din OSA în această gazdă bacteriană.

Idei principale

• OSA este precursorul central al mai multor meroterpenoizi cu activități anticancer, antiinflamatoare și antidiabetice.
• Introducerea genelor de biosinteză în E. coli permite producerea OSA, inițial la niveluri foarte reduse.
• Interferența CRISPR asupra căilor metabolice competitoare crește semnificativ producția, în special prin reprimarea fadR.
• Supraexprimarea enzimelor implicate în furnizarea de acetil-CoA și malonil-CoA determină o creștere majoră a titrului de OSA.
• Optimizarea condițiilor de cultură duce la o producție de 202 mg/L OSA.
• Platforma permite biosinteza de novo a acidului grifolic, demonstrând potențialul pentru producerea meroterpenoizilor derivați.

Context științific

Meroterpenoizii derivați din acidul orselinic reprezintă o clasă diversă de metaboliți secundari vegetali, caracterizați printr-un nucleu poliketidic asociat cu lanțuri terpenoidice. Acești compuși sunt în mod tradițional obținuți prin extracție din plante, metodă limitată de:

• variabilitatea condițiilor de creștere;
• randamente scăzute și purificare complexă;
• restricții de conservare pentru anumite specii vegetale.

Din aceste motive, fermentația microbiană devine o strategie atractivă pentru producția sustenabilă a acestor molecule bioactive.

Despre studiu

Construcția sistemului biosintetic în Escherichia coli

Cercetătorii au introdus în tulpini bacteriene gene codificând diferite tipuri de poliketid sintaze. Dintre acestea, combinația dintre enzima vegetală ORS și ciclizaza OAC a permis pentru prima dată:

• producerea detectabilă de OSA în E. coli;
• secreția extracelulară a peste 99 % din OSA sintetizat;
• obținerea unui titru inițial de aproximativ 1,4 mg/L.

Optimizarea metabolică prin CRISPR interference

Pentru a crește disponibilitatea precursorilor acetil-CoA și malonil-CoA, au fost reprimate gene implicate în căi competitoare. Rezultatele au arătat:

• creșterea producției la 15,1 mg/L prin knockdown fadR;
• reducerea expresiei fadR cu aproximativ 80 %;
• efecte limitate ale combinării mai multor knockdown-uri.

Identificarea limitărilor metabolice

Analiza metabolomică a evidențiat:

• niveluri foarte scăzute de malonil-CoA, sugerând rolul său limitativ;
• acumulare crescută de pantotenat și citrat;
• necesitatea amplificării simultane a furnizării de acetil-CoA și conversiei către malonil-CoA.

Ingineria metabolică suplimentară

Supraexprimarea combinată a enzimelor:

• ACC – conversia acetil-CoA în malonil-CoA;
• CoaA – creșterea rezervelor de CoA;
• ACL – regenerarea acetil-CoA din citrat;

a determinat o creștere majoră a producției până la 78,6 mg/L, reprezentând o creștere de aproximativ 6,8 ori față de control.

Optimizarea condițiilor de cultură

Prin ajustarea mediului, sursei de carbon, concentrației de IPTG și temperaturii, producția a atins:

• 202 mg/L OSA la 72 h;
• randament de 6,1 mg/g glucoză;
• productivitate volumetrică de 4,0 mg/L/oră.

Rezultate privind biosinteza meroterpenoizilor

Introducerea unei preniltransferaze vegetale a permis biosinteza intracelulară a acidului grifolic, confirmând funcționalitatea platformei. Totuși:

• randamentul a fost foarte scăzut (<0,1 % din OSA);
• limitările principale sunt disponibilitatea redusă de farnesil-difosfat și activitatea enzimatică scăzută în bacterii.

Discuții și implicații

Rezultatele confirmă că furnizarea precursorilor CoA-dependenți reprezintă factorul critic pentru producția de OSA. Strategia combinată de:

• reprogramare metabolică;
• supraexprimare enzimatică;
• optimizare a culturii;

demonstrează potențialul utilizării E. coli ca platformă pentru producerea metaboliților secundari vegetali cu valoare farmaceutică.

Limitări

• Producția rămâne sub nivelul necesar pentru aplicații industriale.
• Formarea produsului secundar orcinol reduce randamentul OSA.
• Biosinteza meroterpenoizilor este limitată de disponibilitatea precursorilor terpenoidici.

Concluzii

Ingineria metabolică a Escherichia coli permite producerea eficientă a acidului orselinic și demonstrează fezabilitatea biosintezei de novo a meroterpenoizilor derivați. Deși sunt necesare optimizări suplimentare pentru aplicații industriale, această abordare reprezintă un pas major spre producția sustenabilă de compuși naturali bioactivi cu potențial terapeutic./p>