Studiul dezvăluie detalii despre procesul care conduce evoluția și bolile majore

Un studiu condus de cercetători de la NYU Langone Health și Centrul de gene din Munchen de la Ludwig-Maximilians-Universität (LMU) München în Germania aduce noi informații despre mecanismele prin care elementele transpozabile LINE-1 (L1) reușesc să pătrundă în nucleu în timpul mitozei. Studiul evidențiază rolul condensatelor ribonucleoproteice (RNP) formate de proteina ORF1p și ARN-ul L1, care se leagă direct de ADN pentru a facilita retrotranspoziția.
Elementele transpozabile de tip LINE-1 sunt retrotranspozoni autonomi, adică se pot copia și insera în alte regiuni ale genomului printr-un mecanism „copy-and-paste”. Deși constituie aproximativ 17% din genomul uman și contribuie la diversitatea genetică, activitatea lor poate fi dăunătoare, fiind asociată cu boli precum cancerul și neurodegenerarea. L1 codifică două proteine esențiale: ORF1p (cu rol chaperon) și ORF2p (cu activitate endonucleazică și transcriptază inversă). Rolul exact al ORF1p în acest proces a rămas până recent insuficient înțeles.

Despre studiu

Cercetătorii au folosit o combinație sofisticată de metode, inclusiv:

• fotometrie de masă la scară unică,
• fluorescență anisotropă,
• tehnologia „perdele ADN” (pentru imagistica moleculelor unice legate de ADN),
• și microscopie de rezoluție înaltă în celule vii.

Studiul s-a concentrat pe modul în care ORF1p formează oligomeri și se leagă de ARN sau ADN, contribuind la formarea condensatelor RNP esențiale pentru activitatea L1. Au fost analizate interacțiunile dintre ORF1p și ARN de lungime variabilă, formarea condensatelor, afinitatea față de ADN dublu catenar și implicarea acestor complexe în asocierea cu cromatina mitotică.

Rezultate

Oligomerizarea ORF1p este influențată de ARN

• ORF1p formează în principal hexameri (două trimere) prin interacțiuni electrostatice, iar această oligomerizare scade la concentrații mari de sare.
• Adăugarea de ARN duce la disocierea hexamerilor în trimere.
• Legarea de ARN este cooperativă, cu un coeficient Hill de 2,1, sugerând că un trimer legat de ARN favorizează legarea celui de-al doilea.

Trimerii ORF1p au o afinitate crescută pentru ARN, dar se pot lega și de ADN

Afinitatea de legare (Kd) a fost:

• ARN: 3,9 ± 1,1 nM,
• ADN monocatenar: 8,3 ± 1,8 nM,
• ADN dublu catenar: 18,9 ± 1,3 nM.

ARN și ADN concurează pentru același situs de legare pe ORF1p.

Formarea condensatelor RNP necesită un exces de ORF1p

Condensatele se formează atunci când ORF1p este în exces de cel puțin 130 de ori față de ARN. În acest caz, nu toate situsurile de legare pe trimerii ORF1p sunt ocupate de ARN, permițând interacțiuni cu ADN-ul. Doar condensatele super-saturate cu ORF1p se pot lega eficient de ADN.

Condensatele RNP se pot lega de ADN mitotic în celule

Folosind o linie celulară HeLa exprimând ORF1p etichetat cu HaloTag și un reporter GFP pentru retrotranspoziție, autorii au demonstrat că:

• ORF1p formează condensate citoplasmatice care se translocă pe cromatina mitotică după descompunerea membranei nucleare.
• Aceste condensate persistă pe cromatina mitotică și sunt reținute în nucleii fiicelor.

Mutanții ORF1p afectează condensarea și legarea de ADN

• Mutantul His-TEV-ORF1p, cu o extensie la capătul N-terminal, formează condensate dar nu se leagă eficient de ADN și nu induce retrotranspoziție.
• K3A/K4A-ORF1p (cu mutații în patch-ul bazic) și ΔStammer-ORF1p nu formează condensate vizibile în celule și nu se leagă de cromatina mitotică.
• Doar forma sălbatică (WT) a indus expresia GFP în ~2% dintre celule, restul mutantilor nefiind funcționali pentru retrotranspoziție.

Concluzii

Acest studiu evidențiază un mecanism esențial și nou pentru retrotranspoziția LINE-1:

• Condensatele RNP formate de ORF1p și ARN L1 capătă capacitatea de a se lega de ADN doar atunci când ORF1p este prezent în exces.
• Această interacțiune cu ADN-ul are loc în timpul mitozei, când membrana nucleară este descompusă, permițând accesul condensatelor la genom.
• Interacțiunile electrostatice și structurale ale regiunii N-terminale a ORF1p sunt critice pentru formarea acestor condensate și pentru legarea eficientă de ADN.

Astfel, condensatele RNP L1 funcționează nu doar ca agenți de protecție a ARN-ului transpozabil, ci și ca vehicule specializate pentru transportul acestuia către genom, unde poate avea loc inserția. Descoperirea are implicații importante în înțelegerea mobilității genomice și a patologiilor asociate, precum și în dezvoltarea unor strategii de control al activității L1 în boli umane.