Un nou impuls imunitar ar putea extinde accesul la imunoterapie împotriva cancerului

Un studiu realizat la Moffitt Cancer Center și publicat în Journal for ImmunoTherapy of Cancer a investigat modul în care stimularea celulelor B infiltrate tumoral cu ligandul CD40 (CD40L) poate îmbunătăți expansiunea ex vivo a limfocitelor infiltrate tumoral (LIT). Cercetarea s-a concentrat pe două tipuri de tumori solide – melanom și cancer pulmonar non-microcelular (NSCLC).
Imunoterapia cu limfocite infiltrate tumoral (LIT) este o formă de tratament personalizat în care limfocitele extrase din tumori sunt crescute ex vivo și apoi reinfuzate pacientului, cu scopul de a consolida răspunsul imun antitumoral. Studiile inițiale de la National Cancer Institute (NCI) au arătat o rată globală de răspuns (RGR) de aproximativ 50% și un răspuns complet (RC) de 20% la pacienții cu melanom metastatic tratați cu LIT. Ulterior, pe măsură ce terapia cu inhibitori ai punctelor de control imun (IPCI) – în special anti-PD-1 – a devenit tratament de primă linie, s-a constatat că eficiența LIT la pacienții care au progresat deja după IPCI a scăzut la o RGR de 31,4% și un RC de 3,7%.

Actualmente, în melanomul metastatic, aproximativ 50% dintre pacienți sunt expuși riscului de progresie după terapia anti-PD-1. În acest context, LIT devine adeseori opțiune după eșecul IPCI, însă limfocitele T extrase din tumori pot fi deja compromise funcțional de microambientul tumoral și de tratamentele anterioare. Chiar și administrarea LIT ca linie de terapie mai timpurie a arătat, în unele studii, că ratele de răspuns încă rămân la 49% (OR) și 20% (RC), subliniind nevoia de ameliorare a acestui tip de terapie.

O potențială cale de îmbunătățire a producției de LIT este vizarea ex vivo a celulelor ce pot prezenta antigen, precum celulele B și celulele dendritice. CD40 este un receptor de suprafață exprimat de celule prezentatoare de antigen (CPA) – inclusiv de celulele B –, iar CD40L este exprimat majoritar de limfocitele T activate. Interacțiunea CD40-CD40L este esențială pentru activarea și funcția efectoare a atât a CPA, cât și a limfocitelor T. Anterior, s-au testat anticorpi agonici anti-CD40 în vivo, însă toxicitatea limită de doză a întârziat aplicarea largă. În acest context, ipoteza autorilor a fost că activarea acestei căi exclusiv ex vivo poate amplifica selectiv popularea cu LIT și poate crește calitatea lor, fără a produce toxicități sistemice nedorite.

Despre studiu

Metodologie și participanți

În acest studiu, au fost incluse atât probe de melanom, cât și de cancer pulmonar non-microcelular (NSCLC). Tumorile proveneau de la pacienți cu boală metastatică, care au consimțit să doneze țesut tumoral la Moffitt Cancer Center.

Tumorile au fost fragmentate mecanic și digerate enzimatic pentru a obține suspensii de celule unice, apoi crioprezervate. Pentru expansiunea inițială (pre-REP, adică înainte de protocolul rapid de expansiune), celulele tumorale au fost cultivate în prezența a 6000 UI/mL IL-2 (Control) sau în IL-2 plus CD40L (în doze variabile de 60–1000 ng/mL, în funcție de setul de experimente) și un anticorp anti-HA-tag, timp de 3–5 săptămâni. Ulterior, limfocitele obținute au trecut printr-un Rapid Expansion Protocol (REP) cu anti-CD3 și IL-2 pentru a atinge numărul mare de celule necesar în terapie. Compoziția și fenotipul celulelor LIT au fost analiza­te prin citometrie în flux și, în anumite experimente, prin secvențiere ARN la nivel de celulă unică (scRNA-seq). Reactivitatea împotriva tumorii a fost testată prin co-cultură a LIT cu suspensii de celule tumorale autologe și măsurarea interferonului-gamma (IFN-γ) în supernatant. În plus, pentru unele eșantioane de NSCLC, s-au analizat clonotipurile TCR cunoscute a fi reactive la neoantigene, pentru a cuantifica frecvența lor în produsul final.

Date statistice și tehnici de analiză

• Rata de expansiune a LIT a fost evaluată la peste 21 de probe de melanom și 12 probe de NSCLC. Expansiunea a fost considerată reușită dacă s-a obținut un număr semnificativ de limfocite la finalul perioadei de cultură inițială (pre-REP).  
• Chi-pătrat (χ2), Wilcoxon, Mann-Whitney, sau testul t au fost utilizate în funcție de distribuția datelor. S-a folosit DEseq2 pentru analiza diferențială de expresie la scRNA-seq, iar conținutul diverselor populații celulare a fost estimat cu algoritmul xCell din datele de secvențiere ARN de tip bulk.
• Au fost efectuate și run-uri de validare în cadrul facilității de terapie celulară, pentru a verifica dacă numărul de celule poate atinge pragul de cel puțin 5×10¹⁰ LIT, considerat relevant clinic.

Rezultate

Analiza factorilor asociați cu răspunsul la terapia LIT în melanom:

• Eșantioanele de melanom provenite de la 9 respondenți la terapie LIT și 11 non-respondenți au fost analizate prin RNA-seq.  
• S-a observat că abundența celulelor B cu memorie schimbată de clasă și prezența structurilor limfoide tertiare (TLS) erau mai mari la pacienții care au răspuns la terapie.  
• Indicii derivați din semnătura chimokinelor asociate TLS (o „semnătura genei 12-chemokine”) au fost semnificativ mai mari în eșantioanele de la respondenți (p=0,03).

Expansiunea LIT în melanom cu și fără CD40L:

• Într-un set de 21 de probe de melanom, doar 33% dintre ele au reușit expansiunea în condiții de Control (IL-2 simplu), față de 67% cu adaos de CD40L (p<0,05).  
• La nivel numeric, numărul total de limfocite T obținute (atât CD4+ cât și CD8+) a fost semnificativ mai mare (p≤0,01) când s-a folosit CD40L.  
• Fenotipul LIT îmbogățit prezenta o proporție crescută de limfocite efector-memory (CCR7−CD45RA−) și de celule „asemănătoare stem” (CD39−CD69−).  
• În testele de reactivitate antitumorală ex vivo, LIT expandate cu CD40L nu și-au pierdut capacitatea de a secreta IFN-γ și, în anumite cazuri, au evidențiat tumor reactivity chiar și atunci când condiția de Control nu reușise să dezvolte LIT reactive.

Rolul critic al celulelor B în expansiunea LIT:

• Analiza inițială a suspensiilor tumorale a arătat că prezența unei fracții crescute de celule B (CD45+CD3−CD19+) se corelează semnificativ cu succesul expansiunii LIT.  
• Celulele B de tip memorie cu schimbare de clasă (CD27+IgD-) predominau în probele care au reușit expansiunea.  
• Testele de citometrie au arătat că, sub influența CD40L, doar celulele B își măresc puternic expresia moleculelor co-stimulatoare (CD80/CD86) și MHC clasa II, aspect esențial pentru stimularea limfocitelor T.

Date de scRNA-seq:

• Într-un experiment cu 7 pacienți, s-a folosit secvențiere la nivel de celulă unică după 48 ore de cultură cu sau fără CD40L.  
• Prin analiza UMAP, s-a constatat că B-celulele formau clustere distincte în condiția cu CD40L, având 126 gene diferențial exprimate (DEG) față de Control, mult mai multe decât celulele mieloide sau T.  
• Gene cheie cum ar fi CCL22, CD58, CD83 și CD86 erau marcate în plus la celulele B stimulate. Expresia CD58, de pildă, ar putea îmbunătăți adeziunea și activarea limfocitelor T prin interacția cu receptorul CD2.  
• CCL22 (regăsită în special la celulele B de memorie) poate atrage limfocite T helper foliculare (T_fh) și ar putea facilita formarea de structuri similare centrilor germinali în condițiile de cultură ex vivo.

Rezultate în NSCLC:

• În cazul cancerului pulmonar non-microcelular, au fost analizate 12 probe (semănate sub formă de fragmente).  
• Rata de expansiune a LIT a crescut de la 72,5% în condiția Control la 85,4% cu CD40L (p<0,05).
• De asemenea, timpul până la obținerea unui număr suficient de fragmente cu LIT expandate a scăzut cu circa 7 zile în prezența CD40L.  
• O serie de testări cu neoantigene cunoscute a confirmat creșterea procentului de clonotipuri T specifice tumorii (neoantigen-reactive T-cells) în loturile stimulate cu CD40L.

Validări și perspective clinice:

Au fost efectuate run-uri de validare la scară limitată, care au arătat că toate loturile cu CD40L au atins numărul-țintă de celule necesar (peste 5×10¹⁰ LIT), un prag considerat util clinic. Expansiunea mai rapidă și menținerea clonotipurilor reactive indică un potențial ridicat de a ameliora atât eficiența, cât și fenotipul LIT folosite în tratamente. Se așteaptă ca aceste constatări să fie confirmate într-un trial clinic în desfășurare (NCT05681780), în care se investighează dacă LIT obținute cu CD40L prezintă un avantaj terapeutic real în vivo.

În concluzie, stimularea ex vivo a celulelor B cu CD40L a crescut semnificativ expansiunea LIT, atât în melanom cât și în NSCLC, și a îmbunătățit profilul și frecvența limfocitelor cu reactivitate tumorală. Mecanismul principal pare legat de activarea celulelor B și exprimarea crescută de molecule co-stimulatoare și chemochine care susțin interacțiunile T-B. În plus, scăderea timpului necesar pentru a obține un număr terapeutic de LIT și îmbogățirea cu limfocite T „asemănătoare stem” ar putea duce la o mai bună persistență și eficacitate clinică a terapiei bazate pe LIT. Aceste descoperiri oferă o nouă cale pentru optimizarea terapiilor adoptive celulare și pot extinde beneficiile LIT la mai mulți pacienți cu tumori solide.