Noi perspective asupra leziunilor hepatice și regenerării: contribuția transcriptomicii la nivel de celulă unică

Un articol publicat recent în revista eGastroenterology oferă o sinteză amplă a modului în care tehnologiile de transcriptomică la nivel de celulă unică au revoluționat înțelegerea leziunilor hepatice acute și a regenerării hepatice. Studiul trece în revistă literatura actuală și evidențiază rolurile distincte ale diferitelor tipuri celulare în aceste procese, aducând în prim-plan date noi obținute prin secvențierea ARN la nivel de celulă unică (scRNA-seq) și la nivel nuclear (snRNA-seq), precum și prin transcriptomică spațială.
Leziunea hepatică acută reprezintă o afecțiune severă caracterizată prin moarte rapidă a hepatocitelor și inflamație. Capacitatea extraordinară de regenerare a ficatului poate preveni progresia către insuficiență hepatică acută, o condiție cu mortalitate ridicată sau necesitate de transplant hepatic. Până recent, studiile se bazau pe analiza întregului țesut hepatic, fără posibilitatea de a disocia contribuția diverselor populații celulare. Odată cu apariția scRNA-seq și transcriptomicii spațiale, a devenit posibilă cartografierea activităților transcripționale și a interacțiunilor celulare cu o rezoluție fără precedent.

Despre studiu

Tehnologii utilizate în studiul transcriptomic

Analiza la nivel de celulă unică folosește două abordări majore:

• scRNA-seq – ideală pentru celule imune, dar asociată cu stres celular indus de disocierea țesutului;
• snRNA-seq – potrivită pentru mostre umane congelate sau fragile, conservând subtipurile rare.

Sunt utilizate tehnologii variate pentru captarea celulelor și generarea bibliotecilor de secvențiere, precum:

• 10x Chromium (microfluidică pe picături), Drop-seq, BD Rhapsody;
• metode gravitaționale precum Seq-Well și Singleron SCOPE-chip, utile pentru celule vulnerabile.

În plus, transcriptomica spațială permite localizarea în spațiu a transcripților, iar 10x Visium HD (lansat în 2024) a îmbunătățit rezoluția de la 100 µm la 2 µm, comparabilă cu Stereo-seq (500 nm).

Metode de izolare și analiză celulară

Izolarea celulelor se face prin perfuzie enzimatică in vivo (în modele animale) sau digestie ex vivo (în biopsii umane), urmată de sortare celulară (FACS sau MACS). Analiza transcriptomică este realizată prin metode bioinformatice care includ:

• Clustering, inferență de traiectorii și rețele de reglare genetică;
• Etichetare automată a celulelor folosind instrumente AI, precum scDeepSort, TOSICA sau GPTCelltype.

Se subliniază necesitatea unei baze de date de referință completă pentru celulele hepatice pentru a crește acuratețea adnotărilor.

Rezultate

Hepatocite

În regenerarea hepatică, hepatocitele din zona 2 și 3 proliferează pentru a înlocui celulele moarte din zona pericentrală. Celulele fetal-like (Afp+Cdh17+Spp1+) și migratorii (Anxa2+) sunt identificate în apropierea regiunilor necrotice. Acestea prezintă:

• activare a căilor de dezvoltare fetală și motilitate;
• morfologie alungită, tip mezenchimală;
• migrare facilitată de Anxa2 și actina F.

Blocarea Anxa2 întârzie regenerarea, sugerând potențialul său ca țintă terapeutică.

Celule stelate hepatice (HSC)

HSC joacă roluri duale:

• Inițial, HSC activate (Acta2+Col1a1−) secretă citokine proinflamatorii;
• Ulterior, HSC reparative exprimă Col1a1, Col1a2 și HGF pentru refacerea matricei extracelulare.

În regenerarea post-hepatectomie, expresia HGF apare la 8 ore și persistă până în ziua 2, subliniind rolul central al HSC în regenerare.

Celule endoteliale

Endoteliile sinusoidale hepatice secretă factori de semnalizare precum WNT2 și WNT9b. După leziune sau hepatectomie:

• WNT2 este indus în endoteliile pericentrale;
• HB-EGF este produs ca răspuns la stresul mecanic (shear stress) prin activarea YAP1.

Aceste semnale contribuie la regenerarea hepatocitelor și menținerea zonării hepatice.

Macrofage

Macrofagele hepatice includ:

• Kupffer cells (KCs) rezidenți – eliberează citokine proinflamatorii;
• Macrofage derivate din monocite (MoMFs) – trec de la un fenotip inflamator (Ly6Chigh) la unul reparativ (Ly6Clow).

Subtipul Trem2+ al MoMFs este asociat cu fagocitoză și clearance celular. Mice fără Trem2 prezintă reparare hepatică deficitară. În contrast, Trem2+ KCs nu par esențiali pentru regenerare. În faza tardivă (ziua 28), KCs sunt repopulați în principal de moKCs, inclusiv subtipuri Trem2+ și Mmp12+, ambele implicate în refacerea țesutului hepatic.

Concluzie și perspective

Transcriptomica la nivel de celulă unică a oferit o viziune detaliată asupra heterogenității celulare și mecanismelor moleculare implicate în leziunea hepatică acută și regenerare. Studiile revizuite identifică noi stări celulare și potențiale ținte terapeutice în hepatocite, HSC, celule endoteliale și macrofage. Totuși, rămân provocări importante:

• Subtipuri insuficient studiate – granulocite, limfocite;
• Standardizare slabă – metodele diferite de izolare și secvențiere îngreunează integrarea datelor;
• Limitări ale transcriptomicii – nu reflectă pe deplin complexitatea funcțională;
• Necesitatea extinderii – integrarea cu proteomică și metabolomică la nivel unicelular;
• Integrarea inteligenței artificiale – pentru adnotare celulară și inferențe funcționale mai precise.

Pe măsură ce aceste tehnologii devin tot mai accesibile, se preconizează un progres semnificativ în descifrarea mecanismelor leziunii și regenerării hepatice, cu implicații terapeutice importante în afecțiunile acute hepatice.