O proteina nou identificată acționează ca un controlor de trafic pentru replicarea ADN-ului

Replicarea precisă a ADN-ului este esențială pentru transmiterea fidelă a informației genetice. Totuși, în celulele mamifere, procesul de replicare se suprapune adesea cu zone de transcripție activă, unde complexele de polimerază ARN (RNAP) și moleculele de ARN nou-sintetizate pot interfera cu mașinăria de replicare. Aceste interacțiuni, numite conflicte replicare–transcripție, pot duce la deteriorări ale ADN-ului și instabilitate genomică. 
Un studiu amplu publicat în jurnalul Nature a identificat o proteină-cheie, KCTD10, ca fiind un regulator esențial al interacțiunii dintre replicarea ADN-ului și transcripție. Rezultatele arată că KCTD10 acționează ca un adaptor specific pentru ligaza ubiquitinică CUL3, facilitând rezolvarea conflictelor co-direcționale dintre cele două procese și menținând astfel stabilitatea genomului celular.

În celulele eucariote, replicarea ADN-ului începe predominant în regiuni euchromatinice - aceleași zone unde transcripția este activă. Această suprapunere creează un risc ridicat de coliziuni între replizom (complexul de replicare) și ARN polimeraza II (RNAPII). Coliziunile pot fi:

• head-on - replicarea și transcripția se deplasează în direcții opuse, generând rupturi de ADN și activarea căilor de reparare;
• co-direcționale - ambele procese avansează în același sens, considerate anterior mai puțin dăunătoare, dar studiul actual arată că și acestea pot provoca stres replicativ semnificativ în anumite condiții.

KCTD10, o proteină din familia BTB (Broad-Complex, Tramtrack și Bric-à-brac), fusese anterior asociată cu stabilitatea genomului și reglarea prin ubiquitinare, însă rolul ei precis în coordonarea dintre replicare și transcripție nu era cunoscut.

Despre studiu

Cercetătorii au analizat funcția KCTD10 în celule umane utilizând linii celulare U2OS și HEK293T, cu knockdown genetic mediat prin shRNA. Ei au observat că absența KCTD10 determină o acumulare crescută de semnale γH2AX - un marker al deteriorării ADN-ului - și o sensibilitate ridicată la inhibitorii catalitici ai topoizomerazei II (TOP2), cum ar fi ICRF193 și ICRF187. Aceste date indică o implicare directă a KCTD10 în menținerea integrității genomice.

Analizele prin imagistică EdU și experimente cu fibre ADN au arătat o încetinire semnificativă a vitezei furcii de replicare în celulele lipsite de KCTD10. În paralel, s-a observat o creștere a sintezei de ARN nou (prin marcarea cu 5-etinil-uridină), ceea ce sugerează că proteina are un rol dual - atât în controlul transcripției, cât și în facilitarea replicării.

Corelarea dintre replicare și transcripție

Blocarea farmacologică a transcripției cu inhibitorul PG490 a restabilit viteza normală a replicării în celulele KCTD10-deficiente, în timp ce activarea artificială a furcii replicative cu inhibitori PARP nu a avut același efect. Această observație indică faptul că problema primară este generată de conflictele replicare–transcripție, nu de defecte intrinseci ale replicării.

Experimentele de proximitate între PCNA (marker al replicării) și POLR2A (componentă a RNAPII) au arătat o creștere semnificativă a acestor interacțiuni în celulele fără KCTD10, confirmând rolul proteinei în prevenirea și rezolvarea conflictelor replicare–transcripție.

KCTD10 – un senzor al conflictelor co-direcționale

Folosind un sistem plasmidic care permite diferențierea între coliziunile head-on și co-direcționale, cercetătorii au arătat că KCTD10 răspunde specific conflictelor co-direcționale. În absența sa, numărul complexelor de proximitate POLR2A–PCNA crește semnificativ, dar numai în condițiile de replicare și transcripție orientate în același sens.

Analiza genomică CUT&RUN a identificat peste 15.000 de regiuni de legare a KCTD10 după tratamentul cu ICRF193, majoritatea localizate în apropierea promotorilor, acolo unde apar frecvent conflicte replicare–transcripție co-direcționale. 77% dintre aceste interacțiuni s-au dovedit a fi co-direcționale, implicând gene reglate de factori transcripționali precum E2F, YY1 și KMT2D.

Recrutarea CUL3 și mecanismul de rezolvare

În condiții de stres replicativ, KCTD10 formează complexe cu CUL3, PCNA și RNAPII. Prin intermediul motifului PIP de la capătul C-terminal, KCTD10 interacționează cu PCNA, în timp ce o altă regiune interacționează cu subunitățile RNAPII POLR2C și TCEA2 (factor de elongare TFIIS). Această dublă interacțiune permite formarea unui complex multivalent care marchează TCEA2 pentru ubiquitinare.

Procesul de ubiquitinare a TCEA2, dependent de CUL3–KCTD10, duce la îndepărtarea RNAPII de pe cromatină și permite trecerea furcii replicative fără deteriorare. Mutantul KCTD10(R167A), incapabil de auto-asociere, nu poate restabili acest proces, confirmând că dimerizarea KCTD10 este esențială pentru recrutarea CUL3 și rezolvarea conflictelor.

Rolul TCEA2 în remedierea blocajelor replicative

Depleția TCEA2 în celule KCTD10-deficiente a restabilit viteza replicării și a redus formarea de foci γH2AX, demonstrând că persistența TCEA2 pe ADN contribuie la stresul replicativ și la deteriorarea genomului. Ubiquitinarea reziduului K184 de pe TCEA2 este evenimentul cheie care permite eliberarea complexului de transcripție, un proces dependent de activitatea ATPazei VCP/p97.

Concluzii

Studiul identifică KCTD10 drept un component central al mecanismului care coordonează replicarea și transcripția în celulele mamifere. Proteina acționează ca un „senzor de coliziune” pentru conflictele replicare–transcripție co-direcționale, recrutând complexul ubiquitin-ligază CUL3 și promovând remodelarea RNAPII prin ubiquitinarea TCEA2. Astfel, furca de replicare poate trece peste obstacolele generate de complexele transcripționale fără a compromite integritatea ADN-ului.

Mai mult, absența KCTD10 face celulele extrem de sensibile la inhibitorii catalitici ai topoizomerazei II (ICRF193), precum și la inhibitorii ATM și CHK2, sugerând că acest mecanism are o importanță crucială pentru supraviețuirea celulelor sub stres replicativ. Descoperirile deschid noi perspective terapeutice, mai ales în cancer, unde replicarea și transcripția sunt frecvent dereglate.