Antibioticele din mediile de cultură celulară pot modifica proprietățile mecanice și funcțiile macrofagelor

Un studiu condus de Shanghai Jiao Tong University a analizat modul în care combinația de antibiotice penicilină–streptomicină, utilizată în mod obișnuit în culturile celulare, influențează proprietățile mecanice și funcțiile macrofagelor. Cercetarea arată că aceste antibiotice pot modifica rigiditatea celulară, percepția microambientului și capacitatea funcțională a macrofagelor, sugerând că utilizarea lor în experimentele in vitro poate influența rezultatele studiilor asupra sistemului imun.

Idei principale

• Macrofagele sunt celule cheie ale imunității înnăscute și pot adopta fenotipuri proinflamatorii (M1) sau antiinflamatorii (M2).
• Rigiditatea celulară reflectă starea funcțională a macrofagelor și este asociată cu procese precum fagocitoza, migrarea și secreția de citokine.
• Tratamentul cu penicilină–streptomicină a crescut rigiditatea macrofagelor până la aproximativ 2,5 kPa după cinci zile.
• Antibioticele au modificat modul în care macrofagele percep mecanic și biochimic mediul extracelular.
• Tratamentul a crescut stresul oxidativ și a redus capacitatea de fagocitoză.
• Rezultatele sugerează că aceste antibiotice pot induce o reprogramare mecanică și funcțională a macrofagelor.

Context

Macrofagele provin din monocite derivate din celule stem hematopoietice și reprezintă componente centrale ale sistemului fagocitar mononuclear. Ele îndeplinesc funcții esențiale în imunitate, printre care:

• supravegherea imunologică;
• fagocitoza agenților patogeni;
• prezentarea antigenelor;
• reglarea răspunsului imun.

Aceste celule prezintă o plasticitate funcțională ridicată și pot adopta două stări principale:

• macrofage M1, caracterizate prin răspuns inflamator intens și secreția de citokine precum TNF-α, IL-1β și IL-6;
• macrofage M2, implicate în repararea tisulară și controlul inflamației prin citokine precum IL-10 și TGF-β.

Proprietățile mecanice ale celulelor reflectă adesea starea lor funcțională. Studiile anterioare au arătat că macrofagele activate prezintă o rigiditate crescută și o capacitate de adeziune modificată. Totuși, influența medicamentelor utilizate frecvent în culturile celulare asupra acestor proprietăți a fost puțin investigată.

În mod curent, mediile de cultură celulară conțin antibiotice precum penicilină și streptomicină pentru prevenirea contaminării bacteriene. Cu toate acestea, efectele lor asupra fiziologiei macrofagelor nu au fost studiate în detaliu.

Despre studiu

Model experimental

Cercetătorii au utilizat linia celulară de macrofage murine RAW264.7, cultivată în mediu DMEM suplimentat cu ser fetal bovin. Celulele au fost tratate cu o combinație standard de antibiotice utilizată în culturile celulare:

• 100 U/ml penicilină
• 100 μg/ml streptomicină

Tratamentul a fost aplicat timp de 24 de ore sau pe perioade mai lungi pentru evaluarea modificărilor mecanice și funcționale.

Analiza proprietăților mecanice

Rigiditatea celulară a fost evaluată folosind microscopia cu forță atomică, metodă care măsoară deformarea celulei sub acțiunea unei forțe aplicate. Parametrul utilizat pentru caracterizarea rigidității a fost modulul Young, calculat din curbele forță–deplasare.

În paralel, adeziunea celulară a fost analizată prin spectroscopie de forță la nivel de celulă unică, care cuantifică forța necesară pentru detașarea unei celule de substrat.

Analiza expresiei genice

Expresia genelor implicate în mecanotransducție și adeziune celulară a fost evaluată prin RT-qPCR. Au fost analizate gene precum:

• TAZ
• YAP1
• Egr1
• vinculină
• paxilină
• integrina β1

Evaluarea funcțiilor macrofagelor

Studiul a investigat mai multe funcții celulare esențiale:

• nivelul speciilor reactive de oxigen;
• proliferarea celulară;
• capacitatea de fagocitoză;
• migrarea celulară;
• expresia markerilor M1 și M2.

Rezultate

Creșterea rigidității macrofagelor

Tratamentul cu penicilină–streptomicină a determinat o creștere progresivă a rigidității macrofagelor. După 24 de ore, rigiditatea celulară a crescut semnificativ și a continuat să crească până la aproximativ 2,5 kPa după cinci zile.

O creștere accentuată a modulului elastic a fost observată între ziua a doua și a treia, când rigiditatea a crescut de la aproximativ 1,5 kPa la 2,3 kPa.

Efecte asupra adeziunii celulare

Capacitatea de adeziune a macrofagelor a scăzut temporar în primele două zile de tratament, atingând aproximativ 5 nN, dar a revenit ulterior la valoarea inițială de aproximativ 6 nN.

Această scădere temporară a adeziunii a fost asociată cu reducerea expresiei integrinei β1, o proteină esențială pentru interacțiunea dintre celule și matricea extracelulară.

Modificarea percepției microambientului

Antibioticele au influențat modul în care macrofagele percep caracteristicile mecanice și biochimice ale mediului extracelular.

Tratamentul a modificat morfologia celulară pe diferite substraturi:

• a favorizat răspândirea celulară pe colagen tip I și laminină;
• a crescut rotunjimea celulelor pe colagen tip IV;
• a îmbunătățit adeziunea pe suprafețe acoperite cu peptide RGD sau poliaminoacizi.

Modificări ale expresiei genice

Expresia factorilor de transcripție YAP-1 și TAZ, implicați în mecanotransducție și remodelarea citoscheletului, a crescut semnificativ după tratament.

În schimb, expresia integrinei β1 a scăzut, ceea ce poate explica modificările adeziunii și ale interacțiunii cu matricea extracelulară.

Creșterea stresului oxidativ

Nivelurile intracelulare de specii reactive de oxigen au crescut semnificativ în macrofagele tratate cu antibiotice, indicând un nivel crescut de stres oxidativ.

Reprogramarea funcțională a macrofagelor

Analiza markerilor imunologici a arătat o modificare complexă a profilului de activare:

• scăderea expresiei citokinelor proinflamatorii precum TNF și CXCL9;
• creșterea expresiei Arg1 și IL-10;
• reducerea expresiei receptorului MRC1.

Acest profil sugerează apariția unei stări imunologice atipice, diferită de polarizarea clasică M1 sau M2.

Reducerea funcțiilor imune

Tratamentul cu penicilină–streptomicină a afectat două funcții majore ale macrofagelor:

• capacitatea de migrare celulară a fost ușor redusă;
• capacitatea de fagocitoză a scăzut semnificativ.

Aceste efecte pot fi explicate prin creșterea rigidității celulare, care reduce flexibilitatea citoscheletului necesară pentru mișcare și ingestia particulelor.

Concluzii

Rezultatele studiului arată că antibioticele penicilină–streptomicină, utilizate frecvent în culturile celulare, pot avea efecte biologice semnificative asupra macrofagelor.

Acestea includ:

• creșterea rigidității celulare;
• modificarea interacțiunilor cu matricea extracelulară;
• activarea căilor de mecanotransducție YAP/TAZ;
• creșterea stresului oxidativ;
• reducerea capacității de fagocitoză și migrare.

Prin urmare, utilizarea acestor antibiotice în experimentele in vitro asupra macrofagelor poate reprezenta un factor de confuzie important. Autorii subliniază necesitatea reconsiderării utilizării rutină a penicilinei și streptomicinei în studiile care investighează mecanobiologia și funcțiile imune ale celulelor.