Noul design de antibiotice ar putea pune capăt războiului cu bacterii rezistente

Studiul publicat recent în Journal of the American Chemical Society și realizat de un colectiv de cercetători în domeniul chimiei medicinale propune conjugarea vancomicinei cu teixobactina pentru a îmbunătăți activitatea antibiotică împotriva bacteriilor Gram-pozitive, inclusiv a tulpinilor rezistente la vancomicină. Articolul de față oferă detalii despre sinteza acestor noi compuși și despre rezultatele obținute în testele de laborator.
Vancomicina este utilizată clinic încă din 1958 și rămâne un antibiotic de ultimă instanță foarte important împotriva patogenilor Gram-pozitivi, inclusiv Staphylococcus aureus sensibil la meticilină (MSSA) și Staphylococcus aureus rezistent la meticilină (MRSA). Cu toate acestea, au apărut tulpini rezistente, precum Enterococi rezistenți la vancomicină (VRE) și Staphylococcus aureus rezistent la vancomicină (VRSA), îngreunând tratamentul infecțiilor grave.

Teixobactina, descoperită în 2015, este un ciclodepsipeptid format din 11 reziduuri, care acționează prin legarea de pirofosfatul din structura lipidului II al peretelui celular bacterian. Prin această țintire a unei regiuni moleculare considerate invariabile (pirofosfatul), teixobactina a stârnit un interes deosebit, deoarece reduce considerabil probabilitatea apariției rezistenței bacteriene.

Modificările chimice aduse vancomicinei s-au dovedit utile pentru restabilirea activității împotriva bacteriilor rezistente și pentru creșterea permeabilității membranare a moleculei. Cercetările anterioare au arătat că introducerea unor reziduuri cationice (amidine, guanidiniu) pe lanțul vancomicinei poate îmbunătăți semnificativ proprietățile antibacteriene, inclusiv împotriva biofilmelor și a celulelor persister. Această abordare de modificare a vancomicinei a condus la ideea de a o conjuga cu teixobactina sau cu fragmente minimaliste de teixobactină, în speranța obținerii unei activități superioare față de fiecare componentă individuală.

Despre studiu

Metodologie și sinteză

În noul studiu, cercetătorii au încercat să îmbunătățească activitatea vancomicinei și să depășească rezistența la aceasta prin conjugarea cu teixobactină (sau cu fragmente minimaliste de teixobactină). Ideea-cheie a fost ca cele două componente (vancomicina și teixobactina) să recunoască simultan regiuni diferite din structura lipidului II (gruparea d-Ala-d-Ala și pirofosfatul). Conjugatele au fost obținute prin reacția de cuplare EDC (1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimidă) a vancomicinei la un rest de L-lizină (Lys₁₀) din structura teixobactinei.

• Compusul de referință: Lys₁₀-teixobactină (cu un înlocuitor de tip lizină în poziția 10), având activitate bună, dar ușor mai redusă față de teixobactina nativă.
• Conjugatele: s-au sintetizat atât prin legarea vancomicinei de forma completă a Lys₁₀-teixobactinei, cât și prin legarea la fragmente trunchiate ale teixobactinei (care înlocuiesc regiunea lipofilă a codiței cu un grup aromatic).
• Reactivitatea chimică: cuplarea are loc la gruparea amino a restului de lizină (poziția 10), fără a interfera cu gruparea amino-terminală a reziduului N-metil-d-fenilalanină.

Au fost testate mai multe variante de fragmente trunchiate în care regiunea hidrofobă (reziduurile 1-5) a fost înlocuită cu grupuri aromatice (benzoil, para-clorobenzoil, bifenil, para-clorobifenil). S-a examinat și toxicitatea potențială asupra celulelor mamifere (hemoliză pe eritrocite umane și citotoxicitate pe linii celulare HEK-293).

Date statistice și detalii experimentale

Activitatea antibacteriană a fost evaluată prin determinarea concentrației minime inhibitorii (MIC) împotriva unui spectru de bacterii Gram-pozitive:

• Staphylococcus aureus sensibil la meticilină (MSSA)
• Staphylococcus aureus rezistent la meticilină (MRSA)
• Staphylococcus epidermidis
• Bacillus subtilis
• Enterococ rezistent la vancomicină (VRE)

În plus, Escherichia coli (bacterie Gram-negativă) a servit drept control negativ, dat fiind că teixobactina și vancomicina au activitate minimă asupra bacteriilor Gram-negative. Pentru a preîntâmpina adsorbția pe materialele de laborator, s-au efectuat testele în prezența a 0,002% polisorbat 80.

Rezultate

Activitate antibacteriană a conjugatelor

Lys₁₀-teixo-vanco (conjugatul dintre vancomicină și varianta completă de Lys₁₀-teixobactină) a prezentat MIC de 4 µg/mL atât împotriva Staphylococcus aureus rezistent la meticilină, cât și împotriva Enterococilor rezistenți la vancomicină. În condițiile în care vancomicina nu este activă împotriva acestor tulpini rezistente, valoarea de 4 µg/mL este încurajatoare, mai ales că molaritatea corespondentă este chiar mai mică decât în cazul unui analog acetilat al teixobactinei (4 µg/mL, dar concentrație molară aproape de 2,9 µM). De asemenea, s-a demonstrat că un simplu amestec (nelegat covalent) de Lys₁₀-teixobactină și vancomicină nu oferă același efect sinergic (MIC de 8 µg/mL), subliniind necesitatea conjugării chimice.

Conjugatele trunchiate, în care coada hidrofobă a teixobactinei a fost înlocuită cu grupuri aromatice, au evidențiat rezultate și mai promițătoare:

• Benzoyl-Lys₁₀-teixo7–11-vanco:
  • MSSA: MIC de 0,5 µg/mL (comparativ cu 1 µg/mL pentru vancomicină)
  • MRSA: MIC similar cu cel al vancomicinei (1 µg/mL sau 2 µg/mL, depinde de lot)
  • B. subtilis: <0,031 µg/mL (față de 0,125–0,25 µg/mL pentru vancomicină)
  • VRE: 32 µg/mL (vancomicina este inactivă)
• p-Chlorobenzoyl-Lys₁₀-teixo7–11-vanco:
  • MSSA: 0,063 µg/mL
  • MRSA: 0,5 µg/mL
  • VRE: 8–16 µg/mL
• Bph-Lys₁₀-teixo7–11-vanco (bifenil):
  • MSSA: 0,125 µg/mL
  • MRSA: 0,5 µg/mL
  • VRE: 4–8 µg/mL
• Cbp-Lys₁₀-teixo7–11-vanco (para-clorobifenil):
  • MSSA: 0,125 µg/mL
  • MRSA: 0,5 µg/mL
  • VRE: 2–4 µg/mL (cea mai bună activitate împotriva acestui patogen)

Test de cinetică a uciderii bacteriilor

Într-un test de tip time-kill efectuat pe Staphylococcus aureus rezistent la meticilină, conjugatul Cbp-Lys₁₀-teixo7–11-vanco (la 2 × MIC, adică 1 µg/mL) s-a dovedit bactericid: numărul de bacterii a scăzut cu aproximativ 3 log₁₀ în 4 ore, în timp ce vancomicina singură (1 µg/mL) nu a inhibat semnificativ creșterea (concentrația bacteriană a crescut ușor).

Evaluarea toxicității

Studiile de hemoliză și citotoxicitate pe celule HEK-293 au arătat că aceste conjugate prezintă o activitate hemolitică și toxică foarte scăzută, mai ales la concentrații sub 50–100 µg/mL, deși există o ușoară creștere a hemolizei și a toxicității odată cu introducerea grupelor aromatice mai hidrofobe:

• Benzoyl-Lys₁₀-teixo7–11-vanco și p-chlorobenzoyl-Lys₁₀-teixo7–11-vanco: fără hemoliză la 100 µg/mL și fără citotoxicitate până la 50 µM.
• Bph-Lys₁₀-teixo7–11-vanco: 2% hemoliză la 100 µg/mL și fără citotoxicitate notabilă sub 25 µM.
• Cbp-Lys₁₀-teixo7–11-vanco: 4% hemoliză la 100 µg/mL și ușoară citotoxicitate la 12,5 µM (≈30 µg/mL).

Aceste valori sugerează un indice terapeutic favorabil, care justifică investigații suplimentare in vivo.

Concluzii

Conjugarea vancomicinei cu teixobactina și cu fragmente minimalistice derivate din teixobactină demonstrează o creștere a activității antibacteriene față de bacteriile Gram-pozitive, inclusiv tulpini multirezistente (de tipul Enterococului rezistent la vancomicină). În special, analogii trunchiați conjugați cu vancomicină (care includ grupări aromatice clorurate sau bifenilice) și-au demonstrat eficacitatea la concentrații mult mai mici decât vancomicina singură și au menținut o toxicitate redusă asupra celulelor mamifere.

Cbp-Lys₁₀-teixo7–11-vanco s-a remarcat prin activitatea deosebită împotriva Enterococului rezistent la vancomicină (MIC de 2–4 µg/mL). Mai mult, testele de tip time-kill confirmă efectul puternic bactericid al conjugatelor asupra Staphylococcus aureus rezistent la meticilină. Autorii subliniază faptul că distanța dintre grupele moleculare țintă din lipidul II (d-Ala-d-Ala vs. pirofosfat) sugerează că moleculele conjugate pot interacționa cu doi lipizi II diferiți, însă proiectarea ulterioară a unor spațeri sau legături flexibile adecvate ar putea eficientiza și mai mult procesul de legare și inhibare.

Acest studiu reprezintă un proof-of-concept cu potențial ridicat, deschizând calea spre dezvoltarea unor antibiotice care să combine specificitatea și potența teixobactinei cu versatilitatea vancomicinei. Autorii consideră că viitoare optimizări structurale pot aduce micșorarea și mai accentuată a concentrațiilor minime inhibitoare (sub 1 µg/mL) pentru bacterii problematice precum Enterococii rezistenți la vancomicină și Staphylococcus aureus rezistent la vancomicină.