Oamenii de știință descoperă rolul cheie al cipinei în întărirea conexiunilor celulelor creierului

Un studiu publicat în Science Advances, realizat de o echipă condusă de Sangeeta Gandu, evidențiază un nou mecanism prin care proteina cipină reglează conținutul sinaptic prin policuibiquitinarea legată de lizina 63 (K63), în neuronii rozătoarelor și în creierul adult murin.
Activitatea sinaptică presupune remodelări rapide ale proteinelor sinaptice, procese ce implică sinteză, degradare și transport proteic. Ubiquitinarea, în special policuibiquitinarea prin legături K63, joacă un rol crucial în aceste procese, deși este mai bine caracterizată în contextul cancerului decât în neurobiologie. Dovezile recente sugerează că această modificare afectează stabilitatea PSD-95 și funcția receptorilor glutamatergici, dar mecanismele moleculare implicate rămân incomplet elucidate.

Despre studiu

Metodologie

• Au fost utilizate culturi neuronale primare din cortexul rozătoarelor și modele murine adulte.
• S-au aplicat metode de supraexpresie și knockdown lentiviral pentru cipină, precum și transfectări cu mutanți ai cipinei în HEK293T.
• S-au utilizat western blot, imunoprecipitare, captare de lanțuri K63 și analize proteomice prin spectrometrie de masă.
• Au fost analizate fracțiuni sinaptosomale și total tisulare pentru compararea proteinelor policuibiquitinate și a subunităților proteazomale.

Obiective

Studiul și-a propus să:

• Identifice rolul cipinei în policuibiquitinarea K63 a proteinelor sinaptice.
• Exploreze efectele asupra compoziției proteazomale și a proteinelor sinaptice majore precum PSD-95, GluN2A și GluR1.
• Determine impactul asupra funcției sinaptice, atât la nivel pre-, cât și postsinaptic.

Rezultate

Cipina inhibă activitatea proteazomului și modifică compoziția acestuia

• Cipina se leagă de subunitatea β7 a proteazomului și reduce activitățile chimotripsin-like, tripsin-like și caspază-like.
• Supraexpresia cipinei determină acumularea proteinelor ubiquitinate și a ubiquitinei libere.
• Cipina reduce expresia subunităților 20S, dar nu afectează 19S, influențând compoziția proteazomului la sinapsă.

Cipina reglează policuibiquitinarea K63 în neuroni în dezvoltare

• Supraexpresia cipinei crește selectiv nivelurile K63-polyUb (1,18 ± 0,03), fără a modifica totalul ubiquitinei.
• Knockdown-ul cipinei reduce nivelurile K63-polyUb (0,87 ± 0,05) și crește nivelurile K48-polyUb.
• Proteinele K63-polyUb au fost îmbogățite prin domenii de legare specifice și cuantificate prin western blot.

Cipina modulează enzimele de ubiquitinare

• Supraexpresia cipinei determină creșterea expresiei UBE4A (1,26 ± 0,06), o ligază implicată în formarea lanțurilor K63.
• Nu se observă modificări ale UBE2J1, sugerând o acțiune specifică asupra UBE4A.

Cipina influențează nivelurile receptorilor glutamatergici și PSD-95

• Supraexpresia cipinei crește GluN2A (1,40 ± 0,11), GluR1 (1,28 ± 0,07) și PSD-95 (1,25 ± 0,04), fără a modifica GluN2B.
• Cipina determină creșterea K63-polyUb a PSD-95, demonstrată prin captarea lanțurilor și co-imunoprecipitare.
• Aceste modificări se corelează cu creșterea activității receptorilor NMDA (Ca²⁺ intracelular crescut cu 25%).

Cipina modulează conținutul sinaptic in vivo

• În sinaptosomii din hipocamp murin, supraexpresia cipinei crește totalul proteinelor ubiquitinate și PSD-95, GluN2A, GluR1.
• Cipina reduce lanțurile K48-polyUb, dar nu modifică semnificativ K63-polyUb în sinapsele mature.
• Analizele proteomice identifică modificări ale proteinelor pre- și postsinaptice, cu accent pe zona presinaptică.

Cipina knockout reduce K63-polyUb și proteinele sinaptice

• Knockout-ul cipinei reduce K63-polyUb, PSD-95, GluN2A, GluN2B, GluR1 și SNAP25 în sinaptosomi.
• Cipina reglează nivelurile subunităților 19S (Rpt6 scade la supraexpresie, Rpt5 crește la knockout).

Cipina reglează proteomul policuibiquitinat K63 în sinapse

• 68% din proteinele identificate în fracțiile K63-polyUb coincid cu cele din sinaptosomi, sugerând un efect direct.
• Genele comune sunt implicate în organizarea presinaptică și transportul veziculelor.
• Printre proteinele afectate: CAMK2B, CHRM1 (postsinaptic), NRXN3, SNAP25, SYNPR (presinaptic).

Concluzii

Acest studiu extinde semnificativ cunoștințele despre rolul modificărilor posttranslaționale în sinapse, evidențiind o funcție esențială a cipinei în policuibiquitinarea K63 a proteinelor sinaptice.

Cipina influențează sinapsele atât prin mecanisme dependente de proteazom cât și prin căi independente, contribuind la remodelarea conținutului sinaptic în dezvoltare și plasticitate neuronală.

Implicarea UBE4A și reglarea precisă a subunităților proteazomale sugerează că cipina poate fi o țintă terapeutică valoroasă în tulburări neurodezvoltative sau post-traumatice.