Cercetătorii urmăresc în timp real procesul prin care virusurile gripale invadează celulele umane

Un studiu dedicat mecanicii interacțiunilor dintre virusul gripal A și celulele gazdă a prezentat o tehnologie avansată de imagistică, ViViD-AFM, care combină microscopia de forță atomică cu fluorescența confocală pentru a vizualiza în timp real fenomenele de difuzie virală, atașare la receptorii cu acid sialic și internalizare prin endocitoză mediată de clatrină. Cercetarea publicată în Proceedings of the National Academy of Sciences arată cum optimizarea cantileverului AFM permite observarea fidelă a unui proces biologic extrem de delicat, guvernat de interacțiuni moleculare slabe, de ordinul a 10–25 pN, care până acum nu puteau fi urmărite fără a afecta comportamentul viral natural.
Virusul gripal A prezintă pe suprafață două glicoproteine esențiale pentru infecție: hemaglutinina și neuraminidaza, care gestionează atașarea și eliberarea de pe membrana celulară prin interacțiuni cu acizii sialici. Echilibrul dintre acestea determină mobilitatea laterală a virionului pe suprafața membranei – un pas critic ce precede endocitoza.

Observarea acestor procese la scară nanometrică este îngreunată de faptul că virusul se deplasează pe o membrană de aproximativ 10 nm grosime, iar în timpul difuziei generează modificări topografice subtile. Metodele de microscopie standard nu pot surprinde aceste dinamici, iar AFM convențional poate perturba interacțiunile virion–membrană prin forțele exercitate în timpul scanării.

Prin dezvoltarea unui cantilever extrem de subțire și flexibil, capabil să funcționeze cu o forță de vârf de doar 10 pN, ViViD-AFM devine primul instrument capabil să vizualizeze simultan topografia membranei și particulele virale în mișcare, fără a le destabiliza.

Despre studiu

Conceptul tehnologic: un AFM cu invazivitate minimă

Pentru a reduce influența mecanică a vârfului AFM asupra interacțiunilor virion–membrană, cercetătorii au reproiectat cantileverul, micșorându-i lățimea și păstrând totodată o frecvență de rezonanță ridicată. Noua arhitectură permite:

• reducerea forței minime de scanare la 10 pN, compatibilă cu rezistența legăturilor HA–acid sialic;
• scanare rapidă și stabilă pe celule vii;
• detectarea simultană a fluorescenței virale prin microscopie confocală.

Modelul celular utilizat a fost linia MDCK, cunoscută pentru susceptibilitatea ridicată la multiple subtipuri de virus gripal. În paralel, IAV marcat fluorescent a permis validarea corelativă dintre semnalul structural AFM și particulele virale vizibile optic.

Strategia experimentală

Cu ajutorul ViViD-AFM, cercetătorii au urmărit:

• difuzia laterală a virionilor individuali pe membrana celulară în timp real;
• efectele inhibării neuraminidazei și ale scăderii densității acizilor sialici;
• diferențe de mobilitate între subtipuri virale (H1N1 vs H3N2);
• demonstrarea capturării topografice și fluorescente a virusului neetichetat;
• morfologia membranei înainte și în timpul endocitozei mediate de clatrină.

Rezultate

1. Visualizarea fidelă a difuziei virale

ViViD-AFM a permis observarea clară a particulelor virale individuale glisând pe membrana celulară, cu coeficienți de difuzie specifici distribuți într-un interval larg, influențat de heterogenitatea membranară. Traiectoriile virale au prezentat:

• fluctuații ale mobilității datorate diferențelor locale în densitatea receptorilor;
• diferențe specifice de subtip, H3N2 fiind mai puțin mobil decât H1N1;
• comportamente similare între virusul marcat și cel nemarcat, validând metoda.

2. Impactul neuraminidazei și al acizilor sialici

Manipularea accesului la receptorii sialici a confirmat rolul lor în mobilitatea virală:

• scăderea densității acizilor sialici crește difuzia virală;
• inhibarea neuraminidazei prin oseltamivir reduce mobilitatea;
• temperatura scăzută blochează difuzia, subliniind dependența de fluiditatea membranei.

3. Recrutarea clatrinei limitează mobilitatea virală

Imediat ce particula virală ajunge într-o regiune bogată în receptori și declanșează recrutarea clatrinei, coeficientul de difuzie scade considerabil. Virusul devine „capturat” într-o adâncitură incipientă a membranei – un semn timpuriu al endocitozei.

4. Vizualizarea endocitozei la nivel nanoscopic

Unul dintre cele mai spectaculoase rezultate ale studiului este surprinderea formării unei proeminențe membranare de ~100 nm care acoperă progresiv particula virală odată cu creșterea cuștii de clatrină. Observațiile arată:

• proeminențele sunt bogate în actină și mult mai mari în prezența virusului;
• închiderea adânciturii are loc la aproximativ 60 nm deasupra nivelului membranar;
• procesul este mecanic analog cu evenimentele CME (endocitoză mediată de clatrină) non-virale, dar amplificat;
• virusul internalizat este ulterior transportat rapid spre regiunea perinucleară.

Interpretare

Studiul demonstrează că ViViD-AFM este prima platformă tehnologică capabilă să observe simultan și la rezoluție nanometrică:

• difuzia virală dependentă de receptor;
• semnalele timpurii ale recrutării clatrinei;
• dacă actina contribuie la remodelarea membranei în jurul virusului;
• faza critică a endocitozei, cu deformări membranare dinamice.

Aceste date creează o imagine coerentă a secvenței complete de interacțiune virus–celulă: de la contactul inițial cu receptorii sialici, la migrarea pe suprafața membranei, ancorarea într-un situs endocitic, formarea proeminențelor membranare și internalizarea propriu-zisă.

Mai mult, ViViD-AFM oferă un cadru experimental versatil, aplicabil nu doar virusurilor gripale, ci și altor particule biologice relevante, precum vezicule extracelulare sau nanoparticule lipidice folosite în terapiile moderne.