Rolul variațiilor structurale în evoluția, patogeneza și rezistența la medicamente a Mycobacterium tuberculosis

Un studiu complex publicat în revista Nature Communications a investigat modul în care variațiile structurale din genomul Mycobacterium tuberculosis influențează evoluția patogenului, adaptarea la gazdă și rezistența la medicamente. Cercetarea arată că aceste variații mari – adesea trecute cu vederea în comparație cu mutațiile punctiforme – au un rol esențial în dinamica evolutivă a bacteriei. Studiul folosește date de secvențiere long-read, tehnologii pangenomice și un instrument nou dezvoltat, miniwalk, pentru a caracteriza variațiile structurale și a le lega de mecanisme biologice și fenotipuri de rezistență.
Tuberculoza rămâne una dintre principalele cauze de mortalitate infecțioasă la nivel global, cu peste 10 milioane de cazuri noi și 1,25 milioane de decese într-un singur an. Rezistența la medicamente reprezintă o problemă majoră, aproximativ 400.000 de cazuri fiind rezistente la tratament. Dincolo de mutațiile punctiforme, variațiile structurale – deleții, inserții, duplicări sau inversii de segmente mari – pot influența atât virulența, cât și sensibilitatea la medicamente.

Deși tehnologiile de secvențiere de ultimă generație permit detectarea acestor variații, utilizarea predominantă a secvențierii short-read a limitat până acum înțelegerea pe scară largă a acestor mecanisme. Instrumentele pangenomice, care modelează diversitatea genomului la nivel de populație, deschid noi posibilități pentru cartografierea precisă a acestor variații în mii de izolate.

Despre studiu

Cercetătorii au construit un pangenom de referință al M. tuberculosis folosind:

• 1.363 seturi de date long-read prelucrate pentru calitate și decontaminate;
• 176 genomuri suplimentare din baze de date publice;
• 25 noi izolate secvențiate pentru a acoperi linii filogenetice slab reprezentate.

În total, 859 asamblări genomice au fost incluse în pangenom, reprezentând linii evolutive 1–9 și o diversitate geografică extinsă. Cu ajutorul instrumentului minigraph, cercetătorii au generat un grafic pangenomic ce conține peste 9000 de noduri și sute de zone alternative de secvență.

Pentru genotiparea variațiilor structurale, a fost dezvoltat miniwalk, un instrument conceput să identifice și să compare traseele de traversare ale grafului pentru fiecare izolat, permițând detectarea precisă a delețiilor, inserțiilor, duplicărilor și inversiilor.

Rezultate

Performanța tehnologică și validarea abordării

Comparația pe 16 mostre cu genomuri long-read de înaltă calitate a arătat:

• precizie medie 0,85 și recall 0,82 comparabil cu metodele standard;
• superioritate clară a miniwalk față de metodele pentru date short-read, cu o creștere majoră a preciziei în detectarea inserțiilor și delețiilor mari;
• stabilitate a performanței indiferent de ordinea introducerii genomurilor în grafic.

Peisajul variațiilor structurale

Pe baza asamblărilor long-read, au fost identificate 3.077 variații structurale distincte:

• 1.127 inserții,
• 1.694 deleții,
• 59 duplicări,
• 58 inversii,
• 139 variații de număr de copii.

Multe dintre acestea se află în regiuni genomice asociate virulenței, cum ar fi genele PE/PPE, iar distribuția lor este neuniformă, cu „hotspoturi” evidente într-un interval cu conținut GC ridicat.

Analiza filogenetică a arătat că:

• izolatele moderne (liniile 2–4) prezintă un set diferit de variații față de cele ancestrale;
• liniile specializate au acumulat semnificativ mai multe variații decât cele generaliste, sugerând adaptări la populații gazdă specifice;
• sunt prezente evenimente complexe, precum translocări de zeci de kb care implică zeci de gene.

Impactul asupra sistemelor de secreție ESX

Sistemele ESX, critice pentru patogeneză, au fost analizate pentru diversitatea structurală:

• locusurile ESX-1, ESX-3 și ESX-5 sunt puternic conservate;
• paralogi precum ESX-5c pot lipsi complet în anumite linii africane fără impact asupra viabilității;
• o deleție recurentă ppe25–ppe27, prezentă în ~9% dintre izolate, a fost asociată anterior cu persistență crescută în modele animale.

Evenimente de selecție pozitivă

Screeningul filogenetic a identificat 59 gene afectate repetat de variații structurale în linii diferite, sugerând un rol adaptativ. Printre acestea:

• Rv3177 – implicat în detoxifierea radicalilor oxigen reactivi, posibil compensator pentru rezistența la izoniazid;
• ctpG – exportator de zinc cu rol potențial în adaptarea la micro-medii bogate sau sărace în metale;
• mmpS1 și glnA3 – afectate în sub-linii ale liniei 4 și 2.

O deleție specifică liniei 1.2.1: ctpV

Un rezultat major al studiului este identificarea unei deleții specifice liniei 1.2.1, care afectează ctpV, un exportator de cupru:

• deleția este prezentă doar în acest subtip major răspândit în Asia de Sud-Est;
• transcriptomica arată o acumulare intracelulară crescută de cupru fără toxicitate evidentă;
• aceasta poate susține adaptarea la medii gazdă bogate în cupru și poate contribui la transmisibilitatea crescută a acestei linii.

Asocieri cu rezistența la medicamente

Prin analiza a 41.134 izolate short-read, cercetătorii au identificat variații structurale asociate cu rezistența la:

• izoniazid,
• pirazinamidă,
• etambutol,
• aminoglicozide,
• capreomicină,
• clofazimină,
• delamanid,
• streptomicină.

Printre observațiile notabile:

• deleții în Rv3434c și Rv0738–Rv0741 sunt asociate cu rezistența la izoniazid în izolate fără mutații punctiforme cunoscute;
• inserțiile contribuie la rezistență în cazul streptomicinei;
• gene implicate în biosinteza peretelui celular pot afecta sensibilitatea la pirazinamidă.

Concluzii

Acest rezumat extins evidențiază faptul că variațiile structurale reprezintă un element fundamental al biologiei Mycobacterium tuberculosis. Studiul arată că:

• abordările pangenomice dezvăluie o diversitate genomică mult mai mare decât modelele liniare;
• variațiile structurale influențează atât adaptarea evolutivă, cât și mecanismele de rezistență la medicamente;
• instrumentul miniwalk permite detectarea lor precisă în mii de izolate, inclusiv din date short-read;
• aceste informații pot ghida dezvoltarea de noi teste moleculare și strategii terapeutice.

Studiul deschide drumul către o înțelegere mai integrată a evoluției bacteriene și a rezistenței antimicrobiene, marcând un pas important în utilizarea pangenomii pentru sănătatea publică.