Oamenii de știință au descoperit o modalitate mai sigură de a face celulele să ardă mai multe calorii

Un studiu realizat la Universitatea de Tehnologie din Sydney și publicat în Chemical Science a analizat modul în care noi derivați arilamidici ai acizilor grași pot modula cu precizie gradul de cuplare dintre oxidarea nutrienților și sinteza de adenozin trifosfat în celule. Cercetarea arată că manipularea fină a fluxului protonic mitocondrial permite obținerea unei decuplări ușoare stabile, fără compromiterea producției de adenozin trifosfat.

• Mitocondria transformă energia nutritivă în adenozin trifosfat prin fosforilare oxidativă, un proces dependent de gradientul protonic.
• Decuplarea completă dezorganizează gradientul protonic, inhibă sinteza de adenozin trifosfat și poate produce toxicitate severă.
• Decuplarea ușoară reduce parțial gradientul, stimulează respirația și limitează efectele adverse.
• Noua clasă de arilamide funcționează printr-un mecanism distinct de transport anionic, controlând fin rata fluxului protonic.
• Compușii 5b și 6b acționează ca primii protonofori descriși care produc exclusiv decuplare ușoară.

Context

Fosforilarea oxidativă mitocondrială depinde de formarea unui gradient protonic prin activitatea lanțului de transport al electronilor din membrana internă. Nutrienții sunt oxidați în matrice, generând molecule cu potențial redox ridicat (NADH și FADH₂), care alimentează complexele membranare. Electronii deplasați pompează protoni în spațiul intermembranar, generând un potențial electrochimic care este exploatat de ATP-sintază pentru a transforma adenozin difosfat în adenozin trifosfat.

Protonoforii clasici, precum CCCP și DNP, facilitează scurgerea protonilor prin membrană fără trecere prin ATP-sintază, ceea ce duce la decuplarea completă a fosforilării oxidative. Aceasta crește consumul de substrat și produce efecte metabolice puternice, dar și toxicitate majoră, inclusiv risc de hipertermie. Deși compuși moderni precum BAM15 sau HU6 au îmbunătățit profilul de siguranță, identificarea unor agenți care să inducă exclusiv decuplarea ușoară reprezintă o provocare importantă pentru farmacologie.

O abordare recentă a introdus o nouă clasă de decuplatori – arilureele – care folosesc un mecanism bazat pe transport anionic și formare de dimeri legați de hidrogen. Pornind de la această fundație, studiul actual a dezvoltat analogi arilamidici pentru a evalua dacă rata transportului protonic poate fi ajustată suficient de fin încât să genereze un decuplare ușoară stabil.

Despre studiu

Studiul a investigat o bibliotecă de acizi grași arilamidici, proiectați ca analogi structurali ai arilureelor. Modificările principale au inclus:

• înlocuirea unității uree cu grupare amidică;
• introducerea substituenților clor sau trifluorometil în pozițiile 3,5 sau 3,4 ale nucleului aromatic pentru ajustarea lipofilicității și a proprietăților electronice;
• extinderea lanțului alifatic la 18 atomi de carbon.

Sinteza compușilor a fost realizată în două etape, cu randamente excelente (88–95%). Seria finală (2b–6b) a fost testată inițial pe celule de cancer mamar MDA-MB-231, evaluându-se viabilitatea celulară, respirația mitocondrială, depolarizarea membranei interne și nivelurile de adenozin trifosfat.

Pentru a înțelege diferențele de comportament mitocondrial, compușii au fost evaluați suplimentar în sisteme model cu vezicule artificiale (HPTS assay), permițând cuantificarea ratelor de transport protonic și determinarea parametrilor EC₅₀, coeficienților Hill și influenței substituției aromatice asupra inserției membranare.

Studiul a inclus, de asemenea, analize NMR de legare anionică și dimerizare, precum și modelări computaționale ale orientării dipolare și stabilității complexelor dimerice în medii hidrofobe și hidrofile.

Rezultate

Efecte asupra viabilității celulare

Aryl amida 3b a prezentat activitatea citotoxică cea mai puternică, reducând viabilitatea la 54,7 ± 4,5% (10 µM) și 35,4 ± 6,5% (40 µM). Compușii 2b și 4b au prezentat efecte moderate, în timp ce 5b și 6b nu au afectat viabilitatea celulară, sugerând mecanisme mai puțin agresive asupra metabolismului energetic.

Efecte asupra respirației mitocondriale

Toți compușii au crescut rata de consum al oxigenului, conform analizelor Seahorse, demonstrând activitate uncoupling. Compușii din seria 3,5-disubstituită (2b–4b) au indus creșteri mai mari ale respirației, similare cu protonoforii clasici CCCP și DNP. Seria 3,4-disubstituită (5b–6b) a determinat creșteri mai mici, compatibile cu decuplarea ușoară uncoupling.

Depolarizarea membranei interne mitocondriale

Analizele JC-1 au arătat potențe similare între toți compușii, însă diferențe majore în efectul maxim:

• 2b–4b, CCCP și DNP au atins depolarizări sub 15%;
• 5b și 6b au atins depolarizări stabile de 21,1 ± 1,2% și 34,1 ± 3,2%, indicând o limitare intrinsecă a efectului.

Un analog scurt (C12) al compusului 5b a confirmat că platoul efectului este structural, nu determinat de solubilitate.

Efecte asupra nivelurilor de adenozin trifosfat

Compușii 2b–4b, CCCP și DNP au redus semnificativ producția de adenozin trifosfat după 6 ore, reflectând decuplarea completă. În schimb, 5b și 6b nu au afectat sinteza de adenozin trifosfat, confirmând caracterul de decuplare ușoară.

Ratele de transport protonic

Testele HPTS au arătat valori EC₅₀ similare între compuși, dar diferențe clare în ratele inițiale după preincubare:

• 2b și 3b: rate cele mai mari (până la 18% s⁻¹);
• 4b: rată ridicată după preincubare (8,7% s⁻¹);
• 5b și 6b: rate mai lente, compatibile cu flux protonic limitat.

Constanta D a arătat că compușii 3,5-disubstituiți au nevoie de timp pentru inserția membranară, dar după integrare transportă protoni mult mai rapid decât analogii 3,4-disubstituiți.

Dimerizarea și legarea anionică

Studiile NMR au arătat diferențe majore în dimerizare:

• 2b–4b: constante de dimerizare peste 8200 M⁻¹;
• 5b și 6b: valori mult mai reduse (2367–2826 M⁻¹).

Afinitatea față de anion nu explică diferențele, ceea ce a condus la evaluări computaționale ale orientării dipolare.

Evaluare computațională

Analizele de energie și orientare dipolară au arătat că:

• 3,5-disubstituția reduce unghiul dipolar și aliniază mai bine densitatea de sarcină cu gruparea NH, favorizând dimerizarea;
• 3,4-disubstituția duce la unghiuri dipolare mari și dimeri instabili, limitând fluxul protonic.

Aceste date explică de ce 5b și 6b generează doar decuplare ușoară și oferă principii utile pentru proiectarea viitoarelor anionofori.

Concluzii

Studiul introduce primele exemple de protonofori care produc exclusiv decuplare mitocondrială ușoară. Compușii 5b și 6b reduc parțial gradientul protonic, stimulează moderat respirația și mențin sinteza de adenozin trifosfat chiar la concentrații mari. Diferențele structurale minore între seriile 3,5 și 3,4 evidențiază importanța fină a substituției aromatice în controlul ratei fluxului protonic.

Prin elucidarea relației dintre rata transportului de protoni, dimerizarea intermediarilor și efectele bioenergetice, studiul oferă un cadru conceptual nou pentru dezvoltarea unor agenți farmacologici siguri, eficienți și autoreglați pentru patologii metabolice, oncologice și neurodegenerative.