Un nou microscop expune activitatea ascunsă în interiorul celulelor vii, de la micro la nano

Un studiu realizat la Universitatea din Tokyo și publicat în Nature Communications a analizat relația dintre limitele imagisticii interferențiale convenționale și posibilitatea extinderii domeniului dinamic prin captarea simultană a semnalelor împrăștiate înainte și înapoi în probe biologice vii.
Imagistica cantitativă de fază este folosită pe scară largă pentru vizualizarea fără marcaj a celulelor vii, deoarece oferă contrast bazat pe indicele de refracție și permite obținerea unor informații despre masa uscată celulară sau dinamica organitelor. Totuși, această metodă întâmpină dificultăți în detectarea structurilor nanometrice în mișcare rapidă, din cauza limitelor de sensibilitate și a gamei dinamice restrânse. În contrast, tehnicile de detecție a luminii împrăștiate înapoi, cum ar fi interferometric scattering microscopy, pot vizualiza particule nanometrice datorită sensibilității crescute la împrăștierea de tip Rayleigh, dar nu reușesc să capteze structuri microscopice de tip Mie. Această separare tehnică a capacităților a limitat până acum posibilitatea de a realiza o imagistică celulară completă, care să surprindă simultan atât elementele mari și lente, cât și particulele foarte mici și rapide.

Despre studiul actual

Studiul prezintă dezvoltarea unei tehnologii denumite Bidirectional Quantitative Scattering Microscopy (BiQSM), care integrează într-un singur sistem capabilitățile imagisticii cantitative de fază și ale interferometric scattering microscopy. Abordarea folosește holografie digitală în afara axei cu iluminare bidirecțională și un algoritm de multiplexare în domeniul frecvenței spațiale, permițând înregistrarea simultană a imaginii câmpului împrăștiat înainte (FS) și a celui împrăștiat înapoi (BS) cu un singur obiectiv și un singur senzor.

Autorii descriu un cadru unificat pentru cuantificarea împrăștierii, definit prin amplitudinea câmpului de împrăștiere, calculată atât pentru FS, cât și pentru BS. În acest fel, cele două moduri de detecție devin comparabile direct, iar caracterizarea obiectelor biologice se poate realiza prin corelarea semnalelor lor în ambele direcții de împrăștiere.

Tehnica reușește să extindă domeniul dinamic al detecției prin exploatarea diferențelor fundamentale dintre regimul Rayleigh (particule sub 100 nm) și regimul Mie (structuri peste 100 nm). În timp ce imagistica FS este dominată de lumina neîmprăștiată și de împrăștierea puternică din structuri mari, imagistica BS beneficiază de sensibilitate crescută la fluctuațiile generate de particule nanometrice, deoarece împrăștierea de tip Mie este în mod natural atenuată în direcția înapoi.

Sistemul a fost evaluat prin măsurători pe bile din silica și polistiren cu diametre între 50 și 200 nm, precum și prin imagistică in vivo pe celule COS7. Pentru a depăși zgomotul static generat de substrat și de mișcările lente ale structurilor mari, autorii au folosit analiza diferențială temporală și analiza frecvențială în domeniul timp în două benzi specifice: frecvențe joase (1–10 Hz) și frecvențe înalte (100–250 Hz).

Rezultate

Extinderea domeniului dinamic

BiQSM a demonstrat o creștere de 14 ori a sensibilității în raport cu imagistica cantitativă de fază tradițională, datorită detecției BS mult mai sensibile la împrăștierea Rayleigh. Pragurile minime de detecție pentru FS și BS au fost evaluate la:

• 6,5 × 10⁻³ pentru FS
• 4,6 × 10⁻⁴ pentru BS

Aceste valori permit detectarea, în condiții ideale, a particulelor de aproximativ 30–90 nm în mediu apos, cu BS fiind principalul contributor la creșterea gamei dinamice.

Caracterizarea particulelor prin corelarea FS–BS

Analiza combinată FS și BS a permis diferențierea clară a particulelor de 150 nm (polistiren) și 200 nm (silica), deși imagistica FS singulară nu reușea să distingă între acestea. Folosind corelația celor două direcții de împrăștiere, sistemul a determinat cu precizie:

• Indicele de refracție al particulelor de silica: aproximativ 1,426
• Diametrul estimat: aproximativ 206 nm

Aceste valori au fost foarte apropiate de specificațiile producătorului, demonstrând utilitatea BiQSM pentru caracterizarea cantitativă a particulelor biologice sau sintetice.

Imagistică celulară live cu gamă dinamică extinsă

În celule COS7, modul FS a evidențiat structurile mari, precum nucleul și picăturile lipidice, în timp ce modul BS a scos în evidență structuri nanometrice, inclusiv interferențe provenite de la membrana celulară și particule foarte mici în mișcare rapidă.

Prin analiza diferențială temporală, autorii au identificat picături lipidice mici (sub limita rezoluției laterale) care apăreau doar în BS, sugerând indici de refracție compatibili cu lipidele (~1,45), spre deosebire de veziculele intracelulare (~1,37). Aceasta demonstrează capacitatea tehnicii de a caracteriza particule mici pe baza combinației dintre mărime și indice de refracție.

Analiza frecvențială a dinamicii intracelulare

La 500 cadre pe secundă, studiul a permis segmentarea mișcărilor intracelulare în două regimuri:

• Frecvențe joase (1–10 Hz): mișcări lente ale picăturilor lipidice și ale structurilor mari.
• Frecvențe înalte (100–250 Hz): fluctuații rapide ale particulelor nanometrice din nucleu și citoplasmă.

Autorii au observat heterogenitate în mobilitatea intracelulară, unele picături lipidice având traiectorii largi și lente, iar altele mișcări rapide și locale. BS a identificat semnale dinamice în nucleu, absente în FS, indicând prezența fluctuațiilor rapide ale structurilor nanometrice – posibil asociați cu membrane, complexe proteice sau dinamica cromatinei.

Observarea dinamicii morții celulare

În timpul tranziției către moartea celulară, au fost identificate două faze distincte:

• Stadiul 1 (10–26 minute): accelerarea mișcării particulelor microscopice și creșterea fluctuațiilor rapide detectate în BS; posibil asociate cu perturbări ale citoscheletului sau modificări metabolice tranzitorii.
• Stadiul 2 (26–53 minute): diminuarea sincronizată a mișcărilor atât ale particulelor mari, cât și ale celor nanometrice; posibil corelată cu scăderea fluidității intracelulare odată cu epuizarea adenozin trifosfatului.

Aceste transformări, vizibile simultan în FS și BS, au evidențiat interdependența proceselor care afectează componentele celulare de dimensiuni diferite în timpul degradării stării vitale.

Concluzii

Studiul demonstrează că BiQSM depășește limitările ambelor paradigme tradiționale de imagistică - cantitativă de fază și interferometrică de împrăștiere - oferind o platformă care combină sensibilitatea la particule nanometrice cu capacitatea de a vizualiza structuri microscopice într-un singur sistem coerent și sincron. Prin combinarea detecției FS și BS, tehnica permite atât caracterizarea cantitativă a particulelor, cât și investigarea proceselor dinamice intracelulare pe regiuni largi de frecvență.

strong>BiQSM are potențialul de a deveni o unealtă esențială în studiul proceselor celulare vii, în caracterizarea particulelor biologice și în identificarea timpurie a modificărilor asociate morții celulare.