Un test de sânge rapid, neinvaziv, care poate detecta boala Parkinson înainte de apariția tremorului

Boala Parkinson este una dintre cele mai frecvente boli neurodegenerative, cu un impact major asupra funcției motorii și asupra proceselor cognitive. Diagnosticul clinic devine de obicei evident abia după ce au survenit leziuni semnificative în substantia nigra pars compacta, când apar semne motorii precum bradikinezie, tremor și rigiditate. Totuși, o serie de modificări biologice pot fi detectate cu ani înainte de instalarea semnelor motorii, ceea ce a stârnit interesul pentru dezvoltarea unor teste de diagnostic pre-simptomatic.
În acest context, autorii studiului publicat în jurnalul Nature Aging propun un test sangvin neinvaziv, bazat pe cuantificarea unui raport între două categorii specifice de fragmente de ARN de tip transfer (tRF-uri). Această metodă poate aduce beneficii majore deoarece:

• Se evită procedurile mai invazive, precum puncția lombară pentru lichelul cefalorahidian.
• Se pot monitoriza modificări moleculare complexe într-un mod simplu, folosind reacții PCR rapide și sensibile.
• Oferă posibilitatea de a diferenția pacienții aflați în stadii pre-simptomatice ale bolii Parkinson de indivizii sănătoși, chiar cu o acuratețe comparabilă sau superioară metodei clinice tradiționale.

Fragmentele de ARN de tip tRNA (tRF-uri) sunt scurte segmente de 16-50 nucleotide, generate prin clivarea moleculelor de ARNt. Studiile anterioare au arătat că aceste tRF-uri pot prezenta valori modificate în multiple afecțiuni, inclusiv la nivel cerebral (în boli neurodegenerative) sau sistemic (afecțiuni cardiovasculare și alte boli). În Boala Parkinson, mitocondriile suferă alterări precoce, iar autorii au observat modificări notabile atât în tRF-urile nucleare (N-tRF) cât și în tRF-urile mitocondriale (MT-tRF).

Cercetările anterioare asupra altor biomarkeri (de exemplu α-sinucleina din LCR) au întâmpinat dificultăți legate de:

• Procedura invazivă de recoltare a LCR.
• Specificitate și sensibilitate insuficiente.
• Variabilitate individuală foarte ridicată.

Prin urmare, identificarea unor motifuri repetitive în secvența tRF-urilor, care să ofere un semnal comun pentru tRF-uri provenite din multiple gene de ARNt, devine o strategie valoroasă pentru a reduce zgomotul de fond și a obține un biomarker mai robust.

Despre studiu

Design și obiective

Autorii au analizat date obținute prin secvențiere ARN scurt (small RNA-seq) și prin qPCR, din mai multe surse:

• Probe post-mortem (PM) de lichid cefalorahidian (LCR) și de substantia nigra (SN) de la pacienți cu boală Parkinson (PD) și martori sănătoși.
• Probe de sânge prelevate de la pacienți în stadii incipiente de boală (cohorta PPMI) și pacienți cu boală avansată (cohorta NBB), inclusiv subiecți cu mutații genetice asociate PD.
• Probe de sânge proaspăt de la un spital (Shaare Zedek, Ierusalim) pentru validarea prin qPCR a metodologiei.
• Analize de validare a comportamentului tRF-urilor în urma depolarizării celulare sau procedurii de deep brain stimulation (DBS).

Scopul principal a fost identificarea unui set de tRF-uri care prezintă diferențe semnificative între persoanele cu PD și martori, încă din stadii pre-simptomatice, și dezvoltarea unei metode ușor de implementat în practica medicală.

Metode cheie

• Secvențiere ARN scurt (small RNA-seq) pentru a detecta și cuantifica tRF-urile în diverse probe (sânge, LCR, țesut cerebral).
• Analize bioinformatice: identificarea motivelor comune (de tip RGTTCRA) și compararea tRF-urilor nucleare (N-tRF) cu cele mitocondriale (MT-tRF).
• Algoritmi de învățare automată (gradient boosting machine - GBM) și modelare statistică pentru a testa separarea între PD și controale, mai ales în cohortele cu stadii incipiente.
• Dezvoltarea unui test bazat pe qPCR dual, care să cuantifice simultan fragmente nucleare (cu motivul RGTTCRA) și fragmente mitocondriale (MT-tRF).

Rezultate

Identificarea motivului RGTTCRA în tRF-urile nucleare

În lichidul cefalorahidian și în țesuturile de substantia nigra de la pacienții cu PD, s-au evidențiat tRF-uri nucleare (N-tRF) având o secvență comună [A/G]GTTC[A/G]A (notate „RGTTCRA-tRF”). Acestea erau semnificativ crescute la pacienții cu PD față de controale și absente sau nealterate la pacienții cu Alzheimer, sugerând specificitate pentru boala Parkinson.

Scăderea tRF-urilor mitocondriale (MT-tRF) la pacienții cu PD  

În LCR și în SN, fragmentele mitocondriale (MT-tRF) erau reduse. Autorii au interpretat acest rezultat ca fiind consecința alterărilor mitocondriale timpurii din PD. În sângele colectat post-mortem, nivelurile MT-tRF păreau însă mai mari, un fenomen explicat prin degradarea avansată a mitocondriilor după deces.

Raportul RGTTCRA-tRF / MT-tRF: biomarker robust

Pentru a elimina variabilitatea de concentrație și de profundime a secvențierii, cercetătorii au considerat raportul dintre RGTTCRA-tRF și MT-tRF. Astfel:

• Pacienții PD în stadii incipiente (așa-numiți „prodromali” cu semne neclare) au avut raport semnificativ mai crescut față de controalele sănătoase, cu o putere de discriminare comparabilă sau superioară scorurilor clinice (UPDRS, Hoehn & Yahr) folosite în diagnostic.
• Acest raport a rămas eficient în distingerea pacienților cu PD avansat, indiferent de prezența unor mutații (LRRK2, GBA, etc.).
• Testarea repetată a confirmat reproducibilitatea și sensibilitatea metodologiei, depășind clar nivelul întâmplător.

Validarea prin qPCR simplificată

Autorii au conceput doi „primeri” pentru a amplifica simultan sute de tRF-uri nucleare RGTTCRA și, respectiv, sute de tRF-uri mitocondriale, într-o singură reacție duală. În probe de sânge proaspăt, la pacienții cu PD, raportul dintre semnalul nuclear și cel mitocondrial a fost net mai mare comparativ cu martorii, confirmând utilitatea practic-aplicabilă a testului.

Influența DBS și a depolarizării celulare

La pacienții cu PD care au suferit intervenție de deep brain stimulation (DBS), nivelul RGTTCRA-tRF din sânge a scăzut și s-a apropiat de valorile martorilor, sugerând corelarea cu ameliorarea tremorului și a altor simptome. În studii in vitro cu celule neuroblastom SHSY-5Y, depolarizarea electrică a modificat semnificativ repartizarea RGTTCRA-tRF la nivel ribozomal, indicând potențiale roluri în reglarea traducerii proteice.

Concluzii

Acest studiu demonstrează că fragmentele de ARNt (tRF-uri) care conțin motivul repetitiv RGTTCRA și fragmentele mitocondriale (MT-tRF) se pot folosi ca biomarkeri sangvini pentru diagnosticul bolii Parkinson, încă din fazele pre-simptomatice. Ideile-cheie care susțin utilitatea practică a acestei metode sunt:

• Specificitate și sensibilitate crescute, prin evaluarea a numeroase molecule simultan (mai puțin sensibile la variația dintre indivizi).  
• Tehnică minim invazivă, deoarece necesită doar prelevare de sânge și o reacție PCR duală.  
• Compatibilitate cu testele clinice: raportul RGTTCRA-tRF / MT-tRF poate îmbunătăți capacitatea de screening și diagnostic timpuriu, comparativ cu scorurile clinice standard la pacienții fără simptome motorii evidente.  
• Relevanță biologică: nivelul acestor tRF-uri reflectă stresul mitocondrial și posibile disfuncții de translație la nivel neuronal, fiind corelate cu apariția corpurilor Lewy și cu severitatea simptomelor PD.

Prin urmare, testul bazat pe qPCR dual ar putea reprezenta un instrument promițător pentru diagnosticul precoce al bolii Parkinson, deschizând calea spre intervenții terapeutice mai eficiente și la moment oportun. Validarea extinsă, prin studii longitudinale și pe populații mai diverse, ar putea confirma fiabilitatea și aplicațiile clinice la scară largă.